肿瘤的分子分型30分钟

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1、肿瘤的分子分型及临床检测上海天昊遗传分析中心上海原泰医药科技有限公司丁达2010.4南京dingda@geneskybiotech.com目前临床检测的主要项目与化疗相关的基因mRNA的表达量(ERCC1/BRCA1,TYMS，RRM1,TUBB3,STMN1,TOP2A)与分子靶向相关的基因的突变(EGFR,KRAS,BRAF)基因的拷贝数异常(her2,EGFR)基因的遗传多态性（UGT1A1,CYP2D6）遗传性肿瘤的分子诊断遗传性乳腺癌家族10%的乳腺癌是家族遗传的，其中主要的原因是B

2、RCA1（首选I,55%），BRCA2（首选II,,35%）遗传性非息肉性大肠癌（HNPCC）MSH2(首选1，~60%)，MLH1(首选2,~30%)，MSH6(次选,~4%)家族性结直肠息肉综合症（FAP）首选APC，次选MYH使用的主要技术方法：定量PCR使用的主要技术方法：基因测序FISH荧光毛细管电泳使用的主要技术方法：基因测序突变筛查的关键1、必须采用同一个体正常细胞对照2、必须排除数据库中的SNP多态（大多数公司缺少）3、如何看待突变筛查的灵敏度问题？4、微缺失和插入的检出（测序最佳）5

3、、出现耐药现象后建议对后期的肿瘤组织重新进行突变检查（取材困难）6、未知突变的筛查和确认（探针方法失效）肿瘤基因突变筛查方法优劣比较液相芯片：准确性差（受杂交等条件影响）灵敏度一般未知突变无法筛查可筛查已知的插入缺失突变探针类试剂盒方法：准确性高（98%以上）灵敏度高（探针的优势）未知突变无法筛查对插入缺失筛查的能力差肿瘤基因突变筛查方法优劣比较测序：准确性高（几乎100%）灵敏度一般（测序的灵敏度为10%）可以筛查任何未知突变对插入缺失的判断准确焦磷酸测序：准确性高（几乎100%）灵敏度一般（灵敏度

4、约为10%）可以筛查任何未知突变对插入缺失的判断准确测序片段只有100-150bp，通量太低测序突变筛查的难点石蜡标本的PCR十分困难为了提高成功率采用多次PCR造成的引入突变，造成假阳性纯化方法直接决定了测序质量，天昊平台有改进后的纯化方法，比其他测序公司纯化效果好很多测序数据的分析，需要排除“假突变”，SNP，如何判读插入缺失突变。突变样本的测序结果肺癌胸水标本EGFR外显子21错义突变Leu858Arg肺癌个体化治疗检测方案卡铂（顺铂）ERCC1或BRCA1mRNA紫杉醇（多西紫杉醇）长春瑞滨

5、（长春花碱）TUBB3和STMNmRNA培美曲赛TYMSmRNA吉西他滨RRM1mRNA依托泊苷TOP2AmRNA西妥昔单抗KRAS突变筛查厄洛替尼吉非替尼EGFRKRASB-raf突变筛查举例说明天津肿瘤医院——开始自己做测序，结果反复出现假突变，最后与我们合作。福建肿瘤医院——大肠癌石蜡标本KRAS基因PCR成功率低于50%，且不会排查SNP，后选择与我们合作。定量PCR检测的技术要点必须使用肿瘤组织作为检测对象，组织必须保存在特定的保存液中，石蜡片子中mRNA降解严重，量又少，定量PCR成功率较

6、低。对同一个样本必须使用GAPDH或者B-actin作为对照基因，校正取样细胞数的差异必须进行2重复的定量实验，防止操作失误和随机误差基因表达的高或低是一个相对值，需临床数据和资料才能确定何种表达水平适合用何种治疗方案。定量PCR检测结果石蜡标本mRNA检测作为临床参考的科学性商榷石蜡标本检测出的mRNA水平高低，作为临床化疗的参考，必须十分谨慎，理由如下，请仔细考虑以下两个问题：1年前的石蜡标本所检测的mRNA水平是否会因为降解而低于真实值？1年前病人的组织mRNA水平与现在病人的组织mRNA水平是

7、否会发生剧烈的变化而使检测结果失去参考价值？（就像突变也会随着时间的推移发生新的耐药突变一样）肿瘤治疗的分子分型和异病同治传统的肿瘤的形态学和组织学分类在化疗治疗方面显示出局限性大样本多中心的化疗临床研究为分子分型提供了大量的数据分子分型的结果与临床疗效的研究为肿瘤化疗的同病异治和异病同治提供了科学依据临床遗传分子诊断项目的规范化和标准化运作样本采集要求：实验室质控要求：仪器和试剂的选择：结果分析和解释的要求：原泰-天昊检测平台的优势测序是突变筛查的金标准！尽管灵敏度有所欠缺，但是对于未知突变的检测

8、和准确度都是最好的。国内尚未批准任何一家临床细胞分子遗传学专业医学检验所，原泰-天昊已经着手向卫生部门申请临床细胞分子遗传学专业医学检验所医疗机构许可，其余公司也处于自行检测阶段。突变测序的数据需要详细分析，排除假阳性（例如SNP干扰，例如PCR引入突变等）原泰-天昊检测平台的优势所有的样本都严格要求肿瘤组织，采用血清进行肿瘤细胞的相关指标检测仅停留在科研，由于其假阴性太高，目前为止没有科学意义的。定量PCR检测必须有内参基因作为对照校正取样细胞数差异，