RAW264.7细胞株的传代

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1、·RAW264.7细胞株的传代我养的是RAW264.7细胞株，前面有战友都提到过这种细胞的消化传代，但是因为这种细胞最大的特点是贴壁特别强，每次传代都很难消化下来，刚开始使用胰酶消化，发现37度，消化15min细胞也还是吹不起来，后来又用单纯的用细胞刮刀刮的办法，但是这样养了一段时间，发现细胞损伤非常大，贴壁性变差，生长缓慢，后来使用了现在这个方法，到现在细胞的生长状况一直很好!简述如下：1)将培养瓶内旧的培养液弃掉，然后用D-Hanks液洗两次，(一定要洗干净，以免影响胰酶的消化作用)2)加入0.

2、25%胰酶-EDTA消化，25cm培养瓶加0.4ml，37度消化5min，镜下看到细胞变圆，间隙增大。3)立即加含10%FCS的培养液终止消化，用细胞刮刀轻刮，注意，这时候用吸管吹不下来，但是刮刀却很容易刮下来，而且对细胞的损伤极小4)离心，弃上清，加新的培养液(10%FCS)，小心吹匀，分装入新的培养瓶此法屡试不爽，细胞生长饱满圆润，再也没出现过以前那种情况。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。我的操作如下：实验前将DPBS及DM

3、EM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长，长满瓶底70％时，弃去培养液，加DPBS10ml漂洗一至两次；弃去2、加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可，离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3、分入新的培养瓶；4、入37℃5％CO2孵箱，几小时后即可再贴壁。细胞生长很好。刚从上海细胞库买回来的RAW264.7细胞传了大概5到6代就开始不行了,实验进行不下去.刚开始细胞状态都很好,但是后面就开始很多细胞贴着,消化不下来,后面就都裂解掉.后来又复苏

4、了一瓶细胞,也是传了4代左右就开始不行了.急啊!!搞不懂为什么会这样.有没有人出现这种情况啊?能不能提供一点经验呢?小鼠单核/巨噬细胞RAW264.7本身就比较难消化,在ATCC对该细胞传代的描述中是采用细胞刮棒进行的。我们的经验是,以0.25%胰酶+0.02%的EDTA作为消化液。使用温至室温的消化液进行消化,消化时镜下观察,并用手掌轻拍细胞贴壁的瓶底,约3~5min后,待约10%左右的细胞脱离瓶壁即可终止消化,弃去胰酶,以含10%FBS的DMEM培养基吹打细胞。值得注意的是该细胞对机械损伤比较敏

5、感,所以不要用吸管反复吹打细胞。该细胞很难将瓶内所有细胞都吹下来,所以换瓶传代就行了。看了楼主的描述,感觉是细胞难以耐受机械损伤而导致裂解了。多多交流！我的细胞跟楼主的一样,今天痛苦得不行了,是不是先变成很不规则的多边形然后裂解？多交流阿！我的qq:是啊.就是传几代就不行了.我是都有吹打,如果不吹打的话怎么能成单细胞呢?我现在也不知道怎么办啊刚开始养,还未见异常小鼠单核巨噬细胞RAW264.7的消化及传代：RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢,普通的方法根本就不可能将它消化下来

6、,这也是养这种细胞最头痛的问题。现将我的一点心得,简介如下：消化液：0.5％胰酶、0.2％EDTA,实验前加温到37度以50ml培养瓶为例：1、细胞贴壁生长,长满瓶底80％时,弃去培养液,加D-HANKS漂洗两次；2.加入含胰酶和EDTA的消化液1－2ml,消化37℃约2-5min,镜下可见细胞基本圆形回缩即中止消化,弃消化液加D-HANKS漂洗两次；3.加入新培养液10ml复吹打混悬细胞,按需要分入新的培养瓶RAW264.7RAW264.7因是单核巨噬细胞其生物学特性就是贴壁特别牢。我得操作如下：

7、实验前将DPBS及DMEM加温到37度使用Flask75培养瓶：1、细胞贴壁生长,长满瓶底70％时,弃去培养液,加DPBS10ml漂洗一至两次；弃去2.加入10mlDPBS,然后用scratcher轻轻刮即可,离心后去除DPBS.用DMEM培养液10ml复吹打混悬细胞3.分入新的培养瓶；4.入37℃5％CO2孵箱,几小时后即可再贴壁；4.入37℃5％CO2孵箱,几小时后即可再贴壁。培养条件：1640培养液+四季青10%新生牛血清。PH：2gNaHCO3每1L1640培养液。在我培养的过程中，从来没有

8、用过胰酶消化传代。我一直是直接用弯嘴滴管吹打的。只要按照顺序一片片地吹打，很容易就能够把该细胞吹打下来。吹打一遍之后，置镜下观察哪里还有未吹下的细胞，再着重吹打。吹打过程中，注意用力，要比常规稍加力度以能够吹下细胞。当然，用胰酶消化也是可以的，但是细胞的生长状态就是没有不用直接吹打下来的好。对于RAW264.7细胞，他的生长时喜欢扎堆的。正常的生长状态应该是一小片一小片地生长。片片之间不连接，等到长的更多更密的时候就会连成大片，并且会叠加成层。所以，要很好地控制好细胞