2012overlap原理总结

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1、······················简单讲，原理如下：引物1（正向）和引物2（反向）扩增产物为A；引物3（正向）和引物4（反向）扩增产物为B，现在欲将产物A和B融合为产物C。在设计引物时，先按照普通引物设计好，然后在引物2的5’端和引物3的5'端分别加上4-8个碱基（引物2所加的碱基应为产物B的5'端4-8个碱基序列；引物3所加的碱基应为产物A的3'端4-8个碱基序列）。第一轮PCR，先分别用引物1、引物2扩增出片段A；引物3、引物4扩增出片段B。分别割胶回收产物A和产物B，这样扩增出来的产物A和B会具有相同的末端。第二轮PCR，用引物1和引物4来扩增，用第一轮的两种扩增产物A和B

2、混合稀释之后为模板，进行扩增。因为产物A和B有相同重叠的末端，在PCR反应时，模板变性、退火、延伸，就会将A和B融合成产物C。 overlap能成功，要点是overlap的部分能保证有效的退火（形象地说，能牢固地“粘”在一块）。所以overlap的部分要有一定长度（一般有25bp的重叠区应该够长），并且注意这部分的GC含量，以便使这部分（重叠的25bp）有一个合适的Tm值（例如65度），而且使用的PCR循环所用的退火温度应该低于此温度——否则overlap的部分可能“粘”不到一起。      另外一点是要意识到overlap的前后两段核酸单链有可能形成一定的空间结构！尤其是PCR退火温度较

3、低、降温速度较快时更增加这种情况的几率。前后两段越长越容易形成某种空间结构。而这种空间结构可能会对overlap区的退火造成影响。当然，overlap区本身也有形成某种空间结构的可能（例如发夹结构），但这可以通过软件设计（如引物设计软件）来避免。    如果使用该技术还得不到全长片断，我认为首先要考虑overlap区没有成功退火。遇到这种情况建议使用TouchDownPCR试试。TouchDownPCR方法在分子克隆上有介绍。这种PCR使用一个较高的退火温度，循环几周（如三周）后降一度，然后在此温度上再循环几周，以此类推。通常最高和最低退火温度间可相差十度。TouchDownPCR有利于解

4、决空间结构影响overlap区退火的问题，增加扩增成功的机会。PCR相关网站PCR相关的专业网站一个PCR相关的专业网站，内容很全http://www.pcrlinks.com/实验方法与步骤详解http://swjsx.ntmc.edu.cn/Protocol/home.htm美国AXYgen公司http://www.axygen.com/NewFiles/pcr.htmlhttp://www.alkami.com/This158pagePCRmanualcoversthefollowingtopicsPCRPrimerdesignPCRMethodsPCRPolymerasesPCRV

5、ariablesPCRTroubleshootingSpecialPCRTopicsAppendixesandacomprehensiveIndexBioGuide-PCRhttp://bip.weizmann.ac.il/mb/bioguide/pcr/contents.html魏茨曼基因组和生物信息学研究所的一个网页，介绍PCR的初步知识。包括：WhatisPCR?WhataresomegoodreferencebooksforPCR?HowshouldIselectasetofprimerstouseforPCR?ProgramsfordesigningPCRprimersWhati

6、s"Hot-start"PCR?WhatisAP-PCRorRAPDPCR?Whatis"Touchdown"PCR?Isthereasimplemethodtosequencelambda,M13,orplasmidclonesusingPCR?ALookatPCRCloningToolshttp://www.biooo.com/post/view?b...&sty=1&tpg=63&age=0PCR常见问题及回答http://www.invitrogen.com.cn/techtitle/main/faq_PCR.htm#2PCR和RealtimePCR的原理讲的很透,一个介绍Real

7、timePCR的教学网站，里面的powerpoint文件非常好http://www.med.sc.edu:85/pcr/realtime-home.htmSYBRGreenPCRhttp://www.biooo.com/post/view?b...&ppg=1&age=0#638781PCRQUICKGUIDEhttp://www.wzw.tum.de/gene-quant...bio309/default.htmlPC