pMD18-T使用说明

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1、TaKaRaCode：D101ApMD®18-TVector说明书宝生物工程(大连)有限公司目录内容页码●制品说明1●制品内容1●保存1●纯度1●用途1●pMD®18-TVector的结构1●实验操作2■ControlDNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2■一种可供选择的快速克隆法3●相关说明4●使用注意4●Q&A5●制品说明pMD®18-TVector是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体。本载体由pUC18载体改建而成，在pUC18载体的多克隆位点处的XbaI和SalI识别位点之间插入了EcoRV识别位点，用EcoRV进行酶切反应后，再在

2、两侧的3’端添加“T”而成。因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR产物的3’末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。由于本载体以pUC18载体为基础构建而成，所以它具有同pUC18载体相同的功能。此外，本制品中的高效连接液SolutionI可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。本制品中的ControlInsert（500bp）还可以用于Control反应。●制品内容pMD®18-TVector（50ng/μl）20μl×1支ControlInsert（50ng/μ

3、l）10μl×1支SolutionI*75μl×2支*使用时请于冰中融解。●保存：-20℃●纯度■ControlInsert经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有InsertDNA片段。●用途■进行TA克隆，克隆PCR产物。■对克隆后的PCR产物使用BcaBESTTMSequencingPrimers、M13Primers进行DNA测序。●pMD®18-TVector的结构pMD®18-TVertor(2,692bp)-1-【pMD®18-TVector相关位点说明】Cloningsite425BcaBESTSequencingPrimerM13-47bindingsit

4、e352~375BcaBESTSequencingPrimerRV-Mbindingsite484~507LacZoperator146~475ColE1ori873~1461Ampr1632~2492●实验操作■ControlDNA片段的克隆实验A）操作方法1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。试剂使用量pMD®18-TVector*11μlControlInsert*21μldH2O3μl2）加入5μl（等量）的SolutionI。3）16℃反应30分钟。注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效

5、率稍微降低。4）全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。6）加入890μlSOC培养基，37℃振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。B）结果使用ControlInsert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：1.5×108cfu/μgpUC19DNA。连接/转化效率ControlInsert白色菌落比率（%）效率（%）*（cfu/μgVect

6、or）＋1.7×10698.190以上－1.1×10540.40*效率是指白色菌落中的目的DNAInsert片段的连入效率。■一般DNA片段的克隆实验1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。试剂使用量pMD®18-TVector*11μlInsertDNA*30.1pmol～0.3pmoldH2Oupto5μl2）加入5μl（等量）的SolutionI。-2-3）16℃反应30分钟。注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。③长片段PCR产物（2kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延

7、长至数小时。4）全量（10μl）加入至100μlJM109感受态细胞中，冰中放置30分钟。5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。6）加入890μlSOC培养基，37℃振荡培养60分钟。7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。计数白色、蓝色菌落。8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。■一种可供选择的快速克隆法*41）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5μl。试剂使用量pMD®18-TVector*11μlInsertDNA*30.1pmol～0.3pmol