西北农林科技大学生物技术虚拟实验

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1、生物技术虚拟实验报告棒曲霉抗菌肽基因的克隆和蛋白纯化姓名：罗网班级：生物工程132班学号：2013015383指导老师：张大鹏1.研究目的抗菌肽（antimicrobialpeptide，AMPs）是有机体在真核生物的核糖体和原核生物非核糖体合成的一类小分子碱性多肽（马文山等2008），多有广谱抗菌活性，为大多数生物对入侵病原体的自然防御系统的重要组成部分，具独特的抗菌作用机制，可迅速杀菌，且不易引发细菌的耐药性，传统的抗生素通常是针对单一的酶来控制代谢途径，容易引起细菌的耐药性（MangoniandBhunia2016）。最早被发现的抗菌肽是由瑞典科学家G.Boman等（1972

2、）在惜古比天蚕体内注射E.coliK12D31产生的，定名为Cecropins。后来，人们相继从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物中发现并分离获得具有抗菌活性的多肽（HaleandHancock2007）。细菌、真菌、霉菌等微生物中均发现有抗菌肽，其中，细菌抗菌肽包括阳离子肽和中性肽，G+菌和G-菌均有分泌，且已发现的抗菌肽有杆菌肽（bacitracin）、短杆菌肽S（Sgramicidin）、多黏菌素E（Epolymyxin）、乳链球菌肽（nisin）等4种类型（贾素珍和路福平2000）。本文拟经虚拟实验，克隆棒曲霉基因（Aspergillusclavatus）的AFP

3、抗真菌蛋白序列，构建原核表达载体，并进行蛋白的表达和纯化。2.研究流程图1.实验设计3.1查询抗菌肽基因序列图1搜索目的基因在NCBI的nucleotide数据库中查找棒曲霉抗菌肽基因,筛选得到fasta格式的非冗余序列。图2导出FASTA文件得到的序列为：XM_001267786ATGAAGGTCGTTTCTCTCGCTTCTCTGGGTTTCGCCCTCGTCGCTGCCCTTGGCGTGGTAGCCAGCCCCGTGGATGCCGATTCTCTCGCCGCAGGTGGTCTGGACGCAAGAGACGAGAGCGCCGTTCAAGCCACATACGACGGTAAATGCTAC

4、AAGAAGGACAATATCTGCAAGTATAAGGCACAGAGCGGCAAGACGGCCATTTGCAAGTGCTATGTCAAAGTGTGCCCCCGAGACGGCGCGAAGTGCGAGTTTGACAGCTACAAGGGCAAGTGCTACTGCTAG图3检索开放阅读框3.2寻找开放阅读框在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi上搜索ACCESSION号，得到ORF区域，+1囊括了整个全长基因。3.1寻找载体图4pUC57载体示意图在http://addgene.org/vector-database/网站中进行搜索pUC5

5、7载体，得到该载体的相关信息。载体序列全长为：1tcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccg5051gagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccg100101tcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggctggcttaactatg150151cggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatgcggtgtgaaata200201ccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgccattcgcca

6、tt250251caggctgcgcaactgttgggaagggcgatcggtgcgggcctcttcgctat300301tacgccagctggcgaaagggggatgtgctgcaaggcgattaagttgggta350351acgccagggttttcccagtcacgacgttgtaaaacgacggccagtgaatt400401cgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggatcccgggcccgtc450451gactgcagaggcctgcatgcaagcttggcgtaatcatggtcatagctgtt500501tcctgt

7、gtgaaattgttatccgctcacaattccacacaacatacgagccg550551gaagcataaagtgtaaagcctggggtgcctaatgagtgagctaactcaca600601ttaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtg650651ccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgta700701ttgggcgctcttccgctt