生化分离工程5. 亲和纯化

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1、5.亲和纯化生物亲和作用亲和色谱膜亲和过滤法亲和双水相萃取亲和反胶团萃取亲和沉淀磁性亲和分离5.1生物亲和作用生物亲和作用的本质影响亲和作用的因素亲和作用体系5.1.1生物亲和作用的本质生物分子间的这种特异性相互作用称为生物亲和作用（bioaffinity）或简称亲和作用（affinity）。利用生物分子间的这种特异性结合作用的原理进行生物物质分离纯化的技术称为亲和纯化（affinitypurification）。亲和作用的分子（物质）对可以是：大分子-小分子，大分子-大分子，大分子-细胞，细胞-细胞。具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁

2、孔”的空间结构关系。亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合：静电作用氢键疏水相互作用配位键弱共价键图5-1蛋白质的结合部位及各种结合作用力5.1.2影响亲和作用的因素1.离子强度离子强度影响静电引力、氢键作用、疏水相互作用等。2.pH-羧基的pKa＝3.4～3.8-羧基的pKa＝3.9～4.0-氨基的pKb＝7.4～7.5-氨基的pKb＝10.0～10.43.抑制氢键形成的物质脲和盐酸胍（guanidinohydrochloricacid）的存在可抑制氢键的形成。4.温度温度升高，静电作用、氢键及金属配位键减弱；疏水性相互作用增强。

3、5.离液离子在SCN－，I－和ClO4－等离液阴离子存在下，疏水相互作用降低。6.螯合剂5.1.3亲和作用体系将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联，可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从混合物中高选择性地分离纯化。一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基（ligand），用L表示。Keq越大，亲和结合作用越强。Keq一般为104～108L/mol，最高可达到1015L/mol。表5-1常用的亲和作用体系特异性亲和作用体系高特异性抗原----单克隆抗体荷尔蒙----受体蛋白核酸----互补碱基链段、核酸结合蛋白酶----底物、产物、抑制

4、剂群特异性免疫球蛋白----A蛋白、G蛋白酶----辅酶凝集素----糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体酶、蛋白质----肝素酶、蛋白质----活性色素（染料）酶、蛋白质----过度金属离子酶、蛋白质----氨基酸（组氨酸等）5.2亲和色谱亲和色谱的特点①选择性高、特异性极强②操作条件温和③回收率高亲和色谱的局限性①普遍性、通用性不够②费用高5.2.1亲和色谱填料亲和吸附作用是在特定配基的存在下实现的，需根据目标产物选择适当的亲和配基修饰固定相粒子，制备所需的亲和吸附介质。少数特殊情况如Sephadex凝胶可亲和吸附伴刀豆球蛋白A（一种植物凝集素）

5、。在利用亲和色谱技术纯化目标产物时，商品化的亲和吸附介质往往不能满足特殊目标产物的需要，有必要自制亲和吸附介质。亲和配基1.酶的抑制剂小分子抑制剂有苄脒（benzamidine）、精氨酸和赖氨酸等。2.抗体利用抗体为配基的亲和色谱又称免疫亲和色谱（immunoaffinitychromatography）。抗体与抗原之间的Keq一般为107～1012L/mol。因此，利用免疫亲和色谱法是高度纯化蛋白质类生物大分子的有效手段。3.A蛋白proteinA为分子量约42kD的蛋白质，与IgG具有很强的亲和作用，结合部位为IgG分子的Fc片段。A蛋白分

6、子上含有5个Fc片段可结合部位。不同IgG的Fc片段的结构非常相似，因此A蛋白可作为各种抗体的亲和配基，但不同抗体的结合常数有所不同。A蛋白与抗体结合并不影响抗体与抗原的结合能力，因此A蛋白也可用于分离抗原-抗体的免疫复合体。4.凝集素凝集素（lectin）是与糖特异性结合的蛋白质（酶和抗体除外）的总称。伴刀豆球蛋白A（concanavalinA，conA）可用做糖蛋白、多糖、糖脂等含糖生物大分子的分析、纯化。pH＜5.6时conA为二聚体，分子量为52kD；pH＞5.6时为四聚体，分子量为102kD，两个亚基（subunit）之间通过二硫键结

7、合。因此，在利用conA为配基的亲和色谱操作中，操作条件应当适宜。5.辅酶和磷酸腺苷脱氢酶和激酶与辅酶之间具有亲和结合作用。辅酶主要有NAD（nicotinamideadeninedinucleotide）、NADP（NADphosphate）和ATP（adenosinetriphosphate）等。这些辅酶可用做脱氢酶和激酶的亲和配基。AMP（adenosine5'-monophosphate）、ADP（adenosine2'，5'-diphosphate）的腺苷部分与上述辅酶的结构类似，可用做这些酶的亲和配基。6.三嗪类色素利用色素为配基的

8、亲和色谱法又称色素亲和色谱（Dye-ligandaffinitychromatography）。Triazinedyes是一类分子内含有三嗪环的合成染