实验三-DNA的琼脂糖凝胶电泳

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1、实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳分子生物学实验1一实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。自从琼脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺（polyacrylamide）凝胶被引入核酸研究以来，按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术，已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段，也是现在通用的许多分子生物学研究方法，如：DNA分型、DNA核苷酸序列分析、限制性内切酶片段分析以及限制酶切作图等的技术基础，受到科学界的高度重视。2二实验原理DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。核酸为两性分子，

2、在pH3.5时，整个分子带正电；pH8左右时，整个分子带负电。在碱性环境下，核酸分子之糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离子化状态的，把这些核酸分子放置在电场当中，它们就会向正电极的方向迁移。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。在一定的电场强度下，DNA分子的这种迁移速度，亦即电泳的迁移率，取决于核酸分子本身的大小和构型。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。共价闭环超

3、螺旋DNA＞直线DNA＞开环的双链环状DNA。3二实验原理4凝胶类型及浓度分离DNA片段的大小范围（bp）0.3%琼脂糖50000~10000.7%琼脂糖20000~10001.4%琼脂糖6000~3004.0%聚丙烯酰胺1000~10010.0%聚丙烯酰胺500~2520.0%聚丙烯酰胺50~1凝胶的分辨能力同凝胶的类型和浓度有关，凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小，浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。反之，浓度降低，孔隙就增大，其分辨能力也就随之减弱。5DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压、电场方向、嵌入染

4、料的存在、电泳缓冲液的组成。琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围为0.2~50kb之间6EB(溴化乙锭)能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。电泳时所需DNA样品量仅0.5～1μg.EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中或胶中。EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。EB废液要经过处理才能丢弃。在紫外线的照射下结合

5、溴化乙锭的DNA分子发出荧光7三实验步骤称样溶解加热制板倒胶取样点样电泳检测8三实验步骤制胶——1.0％琼脂糖凝胶(50ml)凝胶板的制备——小心加入2－3μlEB，摇匀（污染EB吸头，不宜再回收使用）点样——样品20μl，与4μl溴酚兰混匀(DNAmaker3μl加入10μl水与4μl溴酚兰混匀)电泳——稳压80v，DNA向阳极移动,大约50-60min观察和拍照——254nm紫外灯下观察9四实验结果五注意事项EB是一种诱变剂，操作时必须戴塑料或乳胶手套!!!六习题琼脂糖凝胶电泳的适用范围？2.影响琼脂糖凝胶电泳的因素有哪些？

6、4泳道maker1泳道质粒DNA2、3、5、6泳道酶切产物123456质粒酶切片段10酶切片段标准DNA/ECo130I13929774362233472269018824ul2ul11