2011级硕士实验课补体依赖细胞毒试验

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1、2011级硕士免疫学实验课闫东梅yxn345@sohu.com补体依赖细胞毒试验实验原理细胞性抗原与特异性抗体(IgG1,2,3或IgM)的结合可激活补体活化的经典途径，引起细胞膜损伤，膜通透性改变而吸收染料，使细胞着色，胀大而死亡，失去正常的折光性。根据死细胞的多少判断细胞毒性的强弱。本次实验采用抗Thy-1血清(Thy-1是T细胞的一种表面标志)与小鼠的胸腺和脾的T细胞相互作用，通过激活补体对胸腺和脾的T细胞进行杀伤。TCell细胞溶解现象补体T细胞+抗Thy-1抗体+MAC实验原理示意图实验分组四人一组，1只小鼠/组。两人做脾，两人做胸腺。物品分配器材名称量/组试剂名称量/组加样

2、器1把PBS10ml吸头12个抗Thy-1血清0.3ml载玻片/盖玻片4套台酚兰1瓶显微镜1台补体0.5ml小试管6支小鼠1只滴管2支平皿1对刻度吸管(5ml)1支剪刀、镊子(直,弯)1套纱布块2块操作步骤将3mlPBS加入平皿中。小鼠脱颈处死，取脾和胸腺(分别位于左侧腹部和胸骨柄处)取胸腺和脾脏分别放到平皿中，用直头镊子固定组织，用弯头镊子轻压组织，将其捣碎，再将3-4层纱布覆盖到组织上，然后用滴管隔着纱布将细胞悬液吸出。按下图加样：>>混匀后放置37℃水浴，孵育40分钟。取出后每管加入50ul台酚兰染液，混匀后立即取出染色的细胞悬液20ul滴到玻片上，用盖玻片盖上，在显微镜下观察。观

3、察结果：计数200个细胞中死细胞数(死细胞形态为肿胀变大，失去折光性，呈兰色)。结果判定：>>加样方法试管阳性管(ml)阴性管(ml)靶细胞100100抗Thy-1血清100—PBS—100补体100100阳性管阳性管阴性管Ag+Ab+CAg+C细胞毒百分率(%)=阳性管活细胞数阴性管活细胞数)×100%(1-结果判定注意事项靶细胞浓度要适中，过高或过低均会影响试验结果。台酚兰染色时间不要太长，因为台酚兰本身具有一定的毒性作用，可致细胞死亡。补体要新鲜采集，三只以上的豚鼠的血清混合。补体依赖性细胞毒实验的应用细胞性抗原的测定单克隆抗体的筛选和鉴定组织相容性抗原的检查与分型