补体溶血实验.ppt

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1、实验三补体溶血实验补体溶血实验补体：一组存在于人和脊椎动物血清中及组织液中具有酶样活性，不耐热和功能上连续反应的糖蛋白，是抗体发挥溶细胞作用的必要补充条件，在正常情况下，血清中的补体大多以无活性酶前体形式存在。物理性质：不稳定，易受各种理化因素的影响，加热，紫外线照射，机械震荡，酸碱和酒精等因素均可破坏补体。灭活：56℃加热30min即可灭活补体系统的生物学功能（1）溶菌和溶细胞作用：补体系统激活后，在靶细胞表面形成MAC，从而导致靶细胞溶解。（2）调理作用：补体激活过程中产生的C3b、C4b、iC3b都是重要的调理素，可结合中

2、性粒细胞或巨噬细胞表面相应受体，因此，在微生物细胞表面发生的补体激活，可促进微生物与吞噬细胞的结合，并被吞噬及杀伤。（3）引起炎症反应：在补体活化过程中产生的炎症介质C3a、C4a、C5a。它们又称为过敏毒素，与相应细胞表面的受体结合，激发细胞脱颗粒，释放组胺之类的血管活性物质，从而增强血管的通透性并刺激内脏平滑肌收缩。C5a还是一种有效的中性粒细胞趋化因子。（4）清除免疫复合物：机制为：①补体与Ig的结合在空间上干扰Fc段之间的作用，抑制新的IC形成或使已形成的IC解离。②循环IC可激活补体，产生的C3b与抗体共价结合。IC借

3、助C3b与表达CR1和CR3的细胞结合而被肝细胞清除。（5）免疫调节作用：①C3可参与捕捉固定抗原，使抗原易被APC处理与递呈。②补体可与免疫细胞相互作用，调节细胞的增殖与分化。③参与调节多种免疫细胞的功能。补体激活的途径：经典途径旁路途径MBL途径相同点：三条途径有共同的末端通路，即形成膜攻击复合物溶解细胞。1、补体经典途径(classicalpathway)：是指以抗原抗体复合物为主要刺激物，使补体固有成分以C1、C4、C2、C3、C5～C9顺序发生酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。2、

4、替代途径（旁路途径）:是指不经C1、C4、C2活化，而是在B因子、D因子和P因子参与下，直接由C3b与激活物结合启动补体酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的补体活化途径。在感染早期可为机体提供有效的防御机制。其激活物是病原微生物等提供接触表面3、MBL途径：在感染早期，体内分泌甘露聚糖结合凝集素(MBL)和C反应蛋白。MBL与细菌表面的甘露糖残基结合，然后与丝氨酸蛋白酶结合形成MASP（MBL相关的丝氨酸蛋白酶），MASP继而水解C4和C2启动后序的酶促连锁反应，产生一系列生物学效应和最终发生细胞溶解作用的

5、补体活化途径。激活物（或激活剂）是炎症期产生的蛋白和病原体。三条途径的区别见下表区别点经典途径旁路途径MBL途径激活物IgG1～3或IgM与Ag复合物脂多糖、酵母多糖、凝聚的IgA和IgG4MBL（甘露聚糖结合凝集素）参与成分C1～C9C3，C5～C9，B、P、D因子同经典途径C3转化酶C4b2bC3bBb同经典途径C3转化酶C4b2b3bC3bnBb同经典途径所需离子Ca2＋Mg2＋Mg2＋同经典途径作用参与特异性免疫在感染后期发作用参与非特性免疫，在感染后期发挥作用同经典途径补体的来源、采集实验室常用豚鼠、兔的新鲜血清作为补

6、体的来源。补体的采集：一般选用3-5只健康未妊娠的豚鼠或兔子，以无菌操作采集血液，采集好的血液置4℃冰箱过夜，次日离心分离血清即可分离到补体。溶血素（抗绵羊红细胞抗体）：是以SRBC作为抗原免疫家兔所得到的兔抗血清，无需进一步提纯，但试验前应先56℃加热30min或者60℃3min灭活补体。溶血反应：由于抗原（红血球）和抗体（溶血素）进行特异性的结合，在电解质存在时能发生凝集，若再有补体参与，红血球则被溶解。实验目的掌握补体测定方法加深了解补体的作用和激活条件材料与试剂试剂1.抗原：2%绵羊红细胞2.抗体：溶血素3.补体：实验室

7、常以健康豚鼠血清作为补体材料:小试管，生理盐水，水浴箱实验方法取试管4支，按下表加入各物试管号溶血素补体2%SRBC生理盐水结果10.50.50.50.520.5-0.51.03-0.50.51.040.50.5（灭活）0.50.5实验方法将上述试管放在37℃水浴箱内30分钟观察有无溶血现象。将不溶血试管离心，3000rpm，5min，使红细胞沉淀。将2、3号管上清液分别移入5、6管，按下表加入试剂实验方法试管号内容物溶血素补体2%SRBC生理盐水结果2管2沉淀物-0.5-2.53管3沉淀物0.5--2.54管4沉淀物-0.5-

8、2.55管2上清液-0.50.5-6管3上清液0.5-0.5-将上述5支试管放入37℃水浴箱内30min观察有无溶血现象，并解释原因实验结果溶血：液体呈红色透明不溶血：呈红细胞混悬液思考题根据所给的条件，请预测哪几管会溶血？哪几管不会溶血？请你详细分析溶血和不溶