RNA提取注意事项

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1、RNA提取心得/经验/体会/纪律（RNA提取注意事项）！纪律一：杜绝外源酶的污染。 注意一：操作环境干净无灰尘，严格戴好口罩，手套。 注意二：实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。 注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。纪律二：阻止内源酶的活性 注意四：选择合适的匀浆方法。 注意五：选择合适的裂解液。 注意六：控制好样品的起始量。纪律三：明确自己的抽提目的 注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。 注意八：RNA抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成

2、功，而不是得率。Rnase污染的10大来源1：手指头–手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。2：枪头，离心管，移液器–单纯的灭菌是不能灭活Rnase的，所以枪头和离心管要用DEPC处理，即使是标明为DEPC处理过的。移液器最好是专用的，用前用75%的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。3：水/缓冲液–一定要确保无Rnase污染。4：实验台面–最起码要用75%的酒精棉球搽拭干净。5：内源Rnase–所有组织均含内源酶，故组织

3、用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。6：RNA样品–RNA抽提产物可能都会含痕量的Rnase污染。7：质粒抽提–质粒抽提往往用到Rnase降解RNA，残留的Rnase要用ProteinaseK消化，PCI抽提。8：RNA保存–即使低温保存，痕量的Rnase亦会导致RNA降解。长期保存RNA的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。9：阳离子(Ca,Mg)–在含这些离子时，80C加热5分钟会导致RNA被剪切，故如果RNA需要被加热，保存液需要含螯合剂(1mMS

4、odiumCitrate,pH6.4)。10：后续实验所用的酶–酶均有可能被Rnase污染。RNase和DEPC处理1：高压灭菌是可以灭活部分RnaseA的。实验证明：37C与RNA反应，没有灭菌的PBS，活性点为100pg/ml；灭菌后，活性点为100ng/ml。当然，灭菌后Rnase仍然不能认为没有残留。2：DEPC在水中半衰期为30分钟。0.1%的DEPC灭菌156分钟可以认为彻底破坏了DEPC。破坏后可以闻到一点气味。3：在1MTris,1MHEPES,1MMOPS中分别加入1ug/mlRnaseA和0.1%及1%DEPC实验。结果提示

5、，0.1%DEPC只对MOPS有效，而1%DEPC对三种试剂都有效。4：0.01%DEPC，0.1%DEPC，1%DEPC有效去除RnaseA　的浓度分别为：100ng/ml，500ng/ml，1ug/ml。但要注意，DEPC灭活后的副产品，对有些后续实验是有影响的。我也来谈谈RNA的提取，我觉得14楼说的方法很严格，但是有时候我们其实不必在过多的细节上太紧张。而在有些步骤一定要小心了。以下的内容，是讲给那些既想偷懒，有希望实验结果有保证的人听的，如果你是习惯于每一步都很严格的人的话，建议还是按照14楼的方法做，因为那样才是正途啊。 好了，下面

6、是给想偷懒，但又不想搞砸实验的战友看的。用最少的时间，Money，力气，来做出最好的结果，是我们的终极目标（PS：我相信一句话，懒人推动科技进步！个人愚见，大家不要拍我啊）。我是做植物的，所以以植物RNA提取为例子：一、关于器皿的处理： 枪头ep管最好是用DEPC处理一下，当然如果老板钱多的话，尽管用进口的RNase-Free的吧。这里，如果你想要偷点懒，也是有办法的，就是少处理一些ep管，因为后面我们会讲到，不是所有的ep管都一定要处理的。 研钵，这个东西按要求是要高温干燥处理的，但是在实际实验中，如果你不处理的话，也不会有太大的影响。因为在

7、一般我们要处理的材料上都会带有很多的RNA酶，设想一下，一个研磨碎了的细胞会释放多少RNA酶出来。所以，在研钵上残留的那些RNase，不是导致你RAN降解的原因。我的做法是，洗干净的研钵，和枪头等一起湿热灭菌即可。如果你真的很急的话，连湿热灭菌也免了。 关于手套、口罩和实验台。手套是一个很重要的东西，这个千万不能省，而且实验过程当中要勤换手套。因为，一般我们在做实验是时候，还要取用很多其他试剂、仪器。所以手套往往是最有可能污染你样品的东西。所以千万记得要换得勤快点。还有，顺便说一下，最好是戴两层PE手套，因为实验过程中，往往手上会出汗，戴一层手

8、套的话，往往脱下来，就很难戴上去了。戴上两层，外层的手套可以方便更换，免得戴不上，还把PE手套夹到ep管里面，这样可是很危险的！至于口罩，我认为，不戴