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时间:2018-07-13
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1、实验十一动物组织细胞总RNA的提取一、实验原理RNA是基因表达的中间产物,存在于细胞质与核中。对RNA进行操作在分子生物学中占有重要地位。获得高纯度和完整的RNA是很多分子生物学实验所必需的,如Northern杂交、cDNA合成及体外翻译等实验的成败,在很大程度上取决于RNA的质量。由于细胞内的大部分RNA是以核蛋白复合体的形式存在,所以在提取RNA时要利用高浓度的蛋白质变性剂,迅速破坏细胞结构,使核蛋白与RNA分离,释放出RNA。再通过酚、氯仿等有机溶剂处理、离心,使RNA与其他细胞组分分离,得到纯化的总RNA。在提取的过程中
2、要抑制内源和外源的RNase活性,保护RNA分子不被降解。因此提取必须在无RNase的环境中进行。可使用RNase抑制剂,如DEPC是RNase的强抑制剂,常用来抑制外源RNase活性。提取缓冲液中一般含SDS、酚、氯仿、胍盐等蛋白质变性剂,也能抑制RNase活性。并有助于除去非核酸成分。本实验介绍异硫氰酸胍法和TRIzol法提取动物组织总RNA并通过电泳进行鉴定。二、仪器和试剂1.仪器:超净工作台、高速冷冻离心机、电泳仪、紫外分光光度计、凝胶成像系统、振荡器、移液器、吸头、Ep管、玻璃匀浆器、试管、玻璃器皿洗净后置180℃烘烤
3、8h;不耐高温的器皿(如塑料制品)应用0.1%DEPC浸泡2h,70~80℃烘烤干燥,120℃高压20min,再70~80℃烘烤干燥方可使用。2.试剂:(1)细胞裂解液:异硫氰酸胍4mol/L柠檬酸钠(pH7.0)25mmol/L十二烷基肌氨酸钠0.5%β-巯基乙醇0.1mol/L称取柠檬酸钠0.64g,十二烷基肌氨酸钠0.415g,吸取β-巯基乙醇0.7ml,用无Rnase的蒸馏水溶解,定容至50ml。然后取以上配制的溶液(CBS液)33ml,异硫氰酸胍25g,混合,完全溶解后4℃保存备用。(2)10×凝胶缓冲液:吗啉代丙璜酸
4、(MOPS)(pH7.0)200mmol/LNaAc100mmol/LEDTA(pH8.0)10mmol/L过滤除菌后避光保存。(3)5×变性上样缓冲液:水饱和的溴酚蓝16μl500mmol/LEDTA(pH8.0)80μl甲醛(37%)720μl甘油2ml甲酰胺3084μl10×凝胶缓冲液4ml加无RNase水至10ml,4℃可保存3个月。(4)TRIzolRNA抽提试剂(5)2mol醋酸钠(6)0.1%DEPC(7)平衡酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)(8)平衡酚、氯仿(9)无水乙醇、70%乙醇、异丙醇(10)无RNase
5、水三、操作步骤(一)异硫氰酸胍法(PLT)1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于组织匀浆器中,加入预冷的细胞裂解液1ml,在冰浴中迅速匀浆15~30s,以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一试管中。2.加入2mol醋酸钠(pH4.0)120μl,充分混匀。3.加入1.2ml酚:氯仿:异戊醇,充分混匀摇振10s,冰浴15min。4.将混合物转移至1.5mlEp管中,4℃,离心10000r/min,20min.5.移取上层水相至另一Ep管中,加入等体积的异丙醇,静置?C20℃,30min沉淀RNA.6.4℃,离心12000r/mi
6、n,15min.7.弃上清液,加入70%乙醇400μl,洗涤RNA沉淀物;如果RNA沉淀物被悬浮,则4℃离心10000r/min,10min。8.弃上清液,自然干燥,但应避免沉淀完全干燥,否则RNA难以溶解。9.加入100μl无RNase水重悬RNA,或加1ml无水乙醇和1/10体积3mol醋酸钠(pH4.0),?C70℃保存。(二)TRIzol试剂提取RNA1.取新鲜动物组织0.1~0.2g置于组织匀浆器中,加入预冷的Trizol液1ml于玻璃匀浆器中,在冰浴中迅速匀浆15~30s,以充分研碎组织。然后将细胞悬浮液吸入另一1.
7、5mlEp管中,于室温下静置5min。2.加入200μl氯仿,剧烈振摇15s混匀后,室温静置3min。3.4℃,10000r/min离心15min,RNA分布于水相中。4.将上层无色水相转移到另一Ep管中,加入500μl异丙醇,室温静置10min。5.4℃,10000r/min离心10min。6.弃上清液,用1ml75%乙醇洗涤RNA沉淀物,4℃,7500r/min离心5min。7.弃上清液,室温干燥15min.8.向干燥过的沉淀物中加入200μlDEPC处理水(无核水)溶解沉淀物,于-20℃保存备用。(三)RNA检测1.在紫外
8、分光光度计上检测RNA浓度及纯度。方法同实验四,用DEPC处理水校正零点;用DEPC处理水稀释RNA样品;读取OD260、OD280值及OD260/OD280的比值。2.琼脂糖凝胶甲醛变性电泳检测(1)制备凝胶(1.2%)。称1.2g琼脂糖,加72mlDEPC处
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