DAPI染DNA的原理及使用方法

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1、DAPI染DNA的原理及使用方法DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，分子式为C16H15N5·2C3H6O3，分子量457.48。DAPI是一种能够与DNA强力结合的荧光染料。它结合到双链DNA小沟的AT碱基对处，一个DAPI分子可以占据三个碱基对的位置。结合到双链DNA上DAPI分子的荧光强度提高大约20倍，常用与荧光显微镜观测，根据荧光的强度可以确定DNA的量。另外，因为DAPI可以透过完整的细胞膜，它可以用于活细胞和固定细胞的染色。在荧光显微镜观察下，DAPI染剂是利用紫外光波长的光线激

2、发。单独DAPI的最大吸收波长为340nm，最大发射波长为488nm；当DAPI与双链DNA结合时，最大吸收波长为364nm，最大发射波长为454nm（10mMTrispH7.0，100mMNaCl，10mMEDTA），其发散光的波长范围含盖了蓝色至青绿色。DAPI也可以和RNA结合，但产生的荧光强度只有与DNA结合的荧光强度的1/5，其发散光的波长范围约在500nm左右。DAPI的配制及贮存固体粉末：避光，2-8℃保存，3年没有问题。贮存液：用无菌水配制成浓度1mg/ml的贮存液，配好后用锡纸包起来，避光，可在-20℃下长期保存。（DAPI易溶于水，在PBS

3、中溶解度不高）使用浓度：贮存液用1xPBS稀释到终浓度100ng/ml。荧光封片液：0.5mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合，pH9.5染色与观察：制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm。注意事项：DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。推荐厂商：Invitrogen，Sigma资料下载：点击下载结构式：DAPI结构式DAPI与DNA的复合物晶体结构以下英文介绍摘自Wikipedia。DAPIor4',6-diamidino-2-

4、phenylindoleisafluorescentstainthatbindsstronglytoDNA.Itisusedextensivelyinfluorescencemicroscopy.SinceDAPIwillpassthroughanintactcellmembrane,itmaybeusedtostainbothliveandfixedcells.Forfluorescencemicroscopy,DAPIisexcitedwithultravioletlight.Whenboundtodouble-strandedDNAitsabsorpti

5、onmaximumisat358nmanditsemissionmaximumisat461nm.(Thisemissionisfairlybroad,andappearsblue/cyan.)DAPIwillalsobindtoRNA,thoughitisnotasstronglyfluorescent.Itsemissionshiftstoaround500nmwhenboundtoRNA.DAPI'sblueemissionisconvenientformicroscopistswhowishtousemultiplefluorescentstainsi

6、nasinglesample.ThereisfluorescenceoverlapbetweenDAPIandgreen-fluorescentmoleculeslikefluoresceinandgreenfluorescentprotein(GFP),orred-fluorescentstainslikeTexasRed,butusingspectralunmixingortakingimagessequentiallycangetaroundthis.Apartfromlabellingcellnuclei,themostpopularapplicati

7、onofDAPIisindetectionofmycoplasmaorvirusDNAincellcultures.BecauseDAPIeasilyenterslivecellsandbindstightlytoDNA,itistoxicandmutagenic.Careshouldbetakeninitshandlinganddisposal.TheHoechststainsaresimilartoDAPIinthattheyarealsoblue-fluorescentDNAstainswhicharecompatiblewithbothlive-and

8、fixed-cellapplicati