罗氏高通量荧光定量PCR技术

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1、www.roche-applied-science.com罗氏高通量荧光定量PCR技术平台--------从基因表达到遗传突变分析的更多解决方案LUYangApplicationSupervisorRocheApplied-science目标分子研究流程：转录和转译水平转录翻译基因：遗传信息的载体目标分子的基因组/表达水平流程SamplesRNA/DNAcDNA/cRNA/DNASpecificDNA目标分子的转译水平流程SamplesRNA/DNAcDNA/cRNA/DNASpecificD

2、NAmRNASpecificProtein蛋白质：生命活动的执行者荧光定量PCR技术平台和生命科学研究课题：切入点？•表达差异性研究•蛋白质结构化学•表达调控研究•蛋白质功能/相互作用转录组学细胞组学蛋白组学结构组学基因组学代谢组学•基因位点突变•甲基化表观遗传学研究SpliceVariantsMethylationCNV高通量测序/芯片平台miRNASNP………..荧光定量PCR技术平台发展：应用领域Overthepast10years,thepopularityofthismethodhasg

3、rownexponentially,withthepublicationofwellover25,000papersfromdiversefieldsofscience,includingagricultural,environmental,industrial,andClinicSurveillancemedicalresearch,makingreferencetoRT(reversetranscription)-qPCRdata.Taylor,S.etal.Methods50,S1-S5(20

4、10)BenchDiscoveryHTPDiagnostics•2006HRMResearch•2000sqPCR•1990sPCRRocheApplied-scienceLightCycler：应用方向和解决方案•GMOdetection•DeletionorInsertion•GeneExpression•Mutation•Genespillover•SNPdetection•Complementaryautomation•MethylationtechnologiestosupportHTPa

5、pplicationsDNAMolecularDosageMarkersNewQualityFrontiersControl•Multiplexing•MIQEguidelines•SinglecellqPCR•Normalization•HTPgeneexpressionprofiling•Validatereferencegene(>384-microplate,empiricallymicro/nano-fluidics)•MIQEGuideline：qPCR实验的标准化流程•目标基因分子的定

6、量/定性分析•内参基因的选择•遗传突变/基因型分析•蛋白质相互作用QualityControl–MIQEGuidelines：qPCRisamultistepassayProposedachecklistthatcontains85parameterstoassurequalityresultsCitedby>300articles(tillJul2011)StephenA.Bustin,Methods50(2010)217–226基因表达-体系优化：一步法还是两步法？•一步法RT-PCR:在同一个

7、管中实现反转录(RT)和PCR过程–一管反应（操作便捷,污染几率小）–快速–需要特异基因引物•两步法RT-PCR：在不同管中实现反转录(RT)和PCR过程–一次反转录，一个cDNA库，多重PCR扩增–多种引物选择(oligodT,randomhexamers,targetspecific)–实现长PCR的扩增（cDNA）引物和探针设计：基于染料法（SYBRGreenI）的引物设计•引物退货温度：60°C；PCR产物长度：100–250bp•借助引物设计软件例如：Primer3（http://prim

8、er3.sourceforge.net）•HPLC纯化•跨内含子设计（mRNA检测）UPL(UniversalProbelibrary)通用探针库：定量分析的最佳工具Length：（8-9）nt，7000条转录本/perprobeReporter：FAMQuencher：LowBackgroundLNA（LockedNucleicAcidTechnology)：锁定核苷酸技术核苷的2、4位形成环氧亚甲基桥结构，提高探针Tm值引物和探针协作跨内含子免费设