实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用

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1、万方数据中国畜牧兽医2008年第35卷第3期生物技术·27·实时荧光定量PCR技术的类型、特点与应用袁亚男．刘文忠(山西农业大学动物科技学院，太谷030801)摘要：实时荧光定量PCR技术是一种利用不同的荧光检测方法来定量核酸的技术，具有高度的灵敏性、特异性和精确性。该技术根据荧光作用方式分为：SYBR荧光染料法、TaqMan技术、分子信标和复合探针等类型，依据其各自优缺点可将各技术方法分别应用于畜牧兽医领域不同方面的科研工作中，以期得到最优的定量检测效率。关键词：实时荧光定量PCR技术；荧光共振能量转

2、移；荧光探针；淬灭探针中图分类号：$813．3文献标识码：A文章编号：1671—7236(2008)03—0027—04实时荧光定量PCR技术(real—timefluores-cencequantitativePCR，RTFQPCR)是1996年由美国AppliedBiosystems公司推出的一种新技术，它不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，具有灵敏度高、特异性强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。作者综述了实时荧光定量PCR技术的基本原理、主要类型、特点及其在畜牧兽

3、医领域的应用。1实时荧光定量PCR技术的基本原理所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时定量PCR仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成PCR-DNA／RNA实时荧光定量检测系统。荧光探针技术是根据标记基团的荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer，FRET)原理而实现的。当某个荧光基团的发射光谱与另一个荧光基团的吸收光谱重

4、叠，且2个基团距离足够近时，能量可以从短波长(高能量)的荧光基团传递到长波长(低能量)的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。定量原理：实时荧光定量PCR是在反应体系中加入荧光基团，使产物的数量与检测到的荧光强度收稿日期：2007—11-16‘作者简介：袁亚男(1983一)，女，山西人，硕士生，研究方向：数量遗传学与动物育种．通讯作者：刘文忠(1968一)，男，山西人，博导，教授，研究方向t数量遗传学与动物育种．E-mailltglwzyc@yahoo。com．Cn基金项

5、目：教育部“新世纪优秀人才支持计划”资助项目(NCET-05-0269)。成线性关系，从而得出产物的扩增曲线。理想的扩增曲线应为J型，符合2N方程(其中N为PCR的循环次数)，但实际上扩增曲线为S型。在PCR反应早期，不能将产生荧光的水平与背景明显区别，之后荧光的产生进入指数期、线性期和最终的平台期，因此可以在指数期的某一点上检测PCR产物的量，并由此推断起始模板含量。实时荧光定量PCR的标准扩增曲线如图1。其中Rn+表示每点测量的荧光强度，代表反应管含有模板DNA；Rn一表示荧光基线强度，代表反应管不

6、含有模板DNA，其在理想情况下是一条平线，只具有背景荧光数值；ARn的值表示PCR过程中，探针降解的量，也即PCR产物的量。基线(baseline)是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到所有反应管的荧光都将要但是还未超出背景(宋敏等，2005)。荧光阈值(threshold)是以PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)，荧光阈值的缺省设置是3"-15个循环的荧光信号标准差的10倍，即：Threshold—IOSD(cycle3～15)，一般认为在荧光阈值

7、以上所测出的荧光信号是一个可信的信号，可以用于定义一个样本的Ct值。Ct值也称阈值循环(thresholdcycle)，指在PCR循环过程中，荧光信号开始由本底进入指数增长阶段的拐点所对应的循环次数，也就是每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。研究结果表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准样品可作出标准曲线，因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。万方数据·28·生物技术中国畜牧

8、兽医2008年第35卷第3期毯0．80豫聪0．40譬0．30靴：0[样品／∥一一J：闷值／Axn_。．一／．●。～T一循环阈值．。一基线⋯。0510152025303540PCR循环数图1实时荧光定量PCR的标准扩增曲线(张晶等，2005)2实时荧光定量PCR技术的类型及特点实时荧光定量PCR技术的常用机制包括荧光染料检测和水解探针检测。2．1SYBRGreenI检测SYBRGreenI是一种能结合到dsDNA小沟部位的具有绿色激发波长的染