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1、WatersChinaLtd.Alliance仪器使用培训启动液相色谱仪器的流程•开启HPLC系统各个设备的电源–打开泵、自动进样器、检测器电源，待设备通过自检后，打开计算机，启动色谱管理软件•准备流动相–过滤,脱气•色谱泵排气–用新配制的流动相灌注泵1启动液相色谱仪器的流程•用准备好的流动相平衡色谱系统系统大约需平衡0.5--1小时方能稳定工作•准备样品–用流动相溶样或重组样品•编制仪器方法,开始实验液相色谱对流动相的要求•色谱柱对流动相的要求–过滤除去微粒–纯度的要求–超纯水，或用KMnO4处理过的双蒸水–有机溶剂：色谱纯(溶剂中的杂质含量尽可能低)，并与
2、填料相匹配–缓冲液的pH值，在填料的允许范围(一般在pH2-8)内–缓冲液（盐）的浓度不要太高(≤100mM)–流动相对样品的溶解度–调整有机溶剂和水的比例–最好用流动相溶样2液相色谱对流动相的要求•液相色谱仪器对流动相的要求∶–与检测器匹配–脱气–避免用含卤素离子的缓冲盐（不锈钢系统）–溶剂的粘度–防止细菌的生长流动相的脱气•流动相脱气的目的–使色谱泵的输液准确–输液量均匀准确，并且脉动减小–保留时间及色谱峰面积的重现性提高–提高检测的性能–防止气泡引起的尖峰–基线稳定，信噪比增加–溶剂的紫外吸收本底降低–保护色谱柱–减少死体积–防止填料的氧化3流动相脱气的
3、方法•加热–简单，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流动相组成的变化•抽真空–同上，一般在溶剂抽滤的同时，也有脱气的效果•超声波振荡–简单，但效果不够理想；超声时间不要太长(1分钟左右即可)•通惰性气体（一般用氦气）–可保持在线连续脱气，多用于低压梯度•在线脱气机（in-linedegasser)–可保持连续脱气，多用于低压梯度流动相的保存•有机溶剂流动相:–室温下密封,避光保存•缓冲盐流动相:–当日现配现用–低温下密封保存,一般不超过3天–防止微生物生长•有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相:–低温密封保存–防止有机相的挥发•选用适宜的容器4保存于聚乙
4、烯瓶中的超纯水测试条件水样:40mltraceenrichment@2.0ml/min色谱柱:C18反相柱(Waters)梯度:线性100%水－100%乙腈波长:254nm2星期1星期1天1小时新鲜配制0510152025分保存于棕色玻璃瓶中的超纯水测试条件水样:40mltraceenrichment@2.0ml/min色谱柱:C18反相柱(Waters)梯度:线性100%水－100%乙腈波长:254nm1星期1天新鲜配制0510152025分5色谱泵的排气操作•色谱泵实验前，应先确认泵头内没有气体，如有气体要按以下步骤排气：–将泵入口管吸滤头放入脱过气的流动
5、相中–打开泵及在线脱气机电源开关–将排液阀打开，或断开与色谱柱连接的管路–设置流速到6-9ml/min,排液阀出口有液流连续流出–必要时(600泵)用10ml注射器从泵入口注入流动相–对于600,2695四元梯度泵,分别对所用各路溶剂进行排气操作–停止泵流速,关闭排液阀,恢复断开的管路,备用•注:泵排气后,应输液稳定(系统压力脉动小,一般在几十•Psi以内),否则,需重做排气操作Waters600泵的前面板泵控制器电源开关柱塞杆排液阀清洗孔泵体泵灌注阀6Waters2695分离单元溶剂瓶盘检测器接液盘前面板显示屏和键盘注射器箱门软盘驱动器柱温箱样品室门溶剂输送
6、单溶剂配比单元元进入门进入门2695排气操作示意图°面板操作:–打开状态(Statas)画面–按右下角DirectFunction功能键–选DryPime或WetPrime命令–选OK即可进行泵的排气°注:–当流路中充满空气时,按图示做DryPrime–若只是更新流动相时,只须作WetPrime7色谱泵的运行°排气后的色谱泵即可用于实验运行–注意∶°排气后，先设流速为0°恢复排气时断开的部分，如:进样器、色谱柱°如需要，恢复排气时断开的控制线°根据色谱柱的不同，逐渐提高流速到设定值°若使用缓冲盐流动相,用前和用后均需用水过渡(包括排气操作)色谱泵的维护保养°流
7、动相要过滤°常用缓冲液时，停泵前要用水清洗泵头，并用水冲洗柱塞杆清洗孔°关闭排液阀时，不要太用力拧紧，以不渗液为准°更换流动相时，要保证两种溶剂的互溶性,如不互溶，要用一种中间溶剂过渡°色谱泵在停用时,应先用水洗去缓冲盐,然后用纯甲醇充满泵头及管路,并保存在纯甲醇中8实验样品的制备°标样和样品–标样:又称对照品,它作为液相色谱定性和定量分析的参考标准物,一般是纯度较高的纯物质–样品:待测物,一般是成分复杂的混合物°液相色谱对样品(包括标样)制备的要求:–必须能溶于流动相°如样品的溶剂不是流动相,一定要用流动相试溶解度,以免在进样时样品在流动相中析出,堵塞管路和
8、色谱柱–样品溶液要过滤除去微粒及杂质–
