StepOneV2.X 相对定量简易操作流程

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1、appliedbiosystemsStepOne/StepOnePlus荧光定量PCR仪相对定量实验简易操作流程SDS2.2相对定量实验简易操作流程StepOne/StepOnePlus定量PCR仪相对定量实验简易操作流程1.双击桌面图标，或从Start>AllPrograms>AppliedBiosystems>StepOneSoftware>StepOneSoftwareV2.2开启软件。进入主界面后选择AdvancedSetup。2.进入Setup下的ExperimentProperties界面：2.1输入实验名称（ExperimentName）2.2确认仪器型号2.32.3在实

2、验类型中，选择Quantitation-ComparativeCT(ΔΔCT)1相对定量实验简易操作流程2.4选择试剂种类2.5确认运行模式3.进入Setup下的PlateSetup界面，设置基因（Target）及样本（Sample）：3.1在左边界面中设置基因及样本。利用按钮添加新的基因，并在TargetName中编辑基因名称，Reporter和Quencher中选择所标记的荧光基团及淬灭基团。对于Quencher的选择，如果是MGB探针，请选择NFQ-MGB；如果是TAMRA探针，请选择TAMRA；如果是其他形式的非荧光淬灭基团（如BHQ），请选择None。2相对定量实验简易操作流

3、程也可利用其他按钮保存（SaveTarget）或删除（DeleteTarget）已添加的基因。利用按钮添加样本，在SampleName中编辑样本名称。3.2在右边界面中进行样品板的排布。利用鼠标单选或拖曳以选择反应孔，然后勾选左侧的基因及样本，同时在Task选项中指定该反应孔的类型（U代表未知样本，N代表阴性对照）。3相对定量实验简易操作流程3.3在SelectRelativeQuantitationSettings中（参看上图）选择对照样本及内参基因。4.在Setup下的RunMethod界面，设定反应条件。TM5.如果想使用StepOnePlus仪器上的VeriFlexBlock温

4、度梯度功能，需要先在TM界面下，勾选EnableVeriFlexBlock选项。此时Block即被分成六个区块。（此功能仅限StepOnePlus机型)4相对定量实验简易操作流程然后在RunMethod界面中，点击想要调整的温度步骤，在弹出的界面中，选择并设定每个区块的温度。两相邻区块的温度差异不能超过5度，即第一与第六区块最多可差异25度。6.点击，将文件存储成ExperimentDocumentSinglefiles(*.eds)格式，然后在Run界面中按下按钮，反应即开始进行。5相对定量实验简易操作流程7.实验结束后，点击界面右上角的Analyze按钮，软件将会显示实验结果：7.

5、1在扩增图中（见上图），可通过更改PlotSettings来改变扩增图的显示方式。如果想查看阈值线或基线，请将Threshold及Baseline打勾。7.2查看相对表达量结果时，利用PlotSettings选项，以不同方式显示表达量的结果。6相对定量实验简易操作流程7.3对于SYBRGreen法实验，可以在MeltCurve界面中查看熔解曲线。7.4检查QCSummary结果，可以快速查看实验中是否有反应孔存在异常情况。黄色三角中的数字1代表有一种异常情况，2代表有两种异常情况，以此类推。详细信息及解决方案可以在FlagDetails中看到。7相对定量实验简易操作流程8.分析之后的结

6、果，可以利用菜单中的File>Export功能，导出Excel格式的结果。若想存储图片，可直接在图片上单击鼠标右键，选择Saveas，存成JPEG格式的图片。8相对定量实验简易操作流程9