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1、液相色谱实用技术(一)HPLC定量原理及方法液相色谱定量分析的基本原理❀在定性的基础上定量,需有纯物质作为标准物❀液相色谱定量是相对定量的方法:即由已知量的纯被测物标样推算混合物中被测物的量❀液相色谱法定量的依据是:✎被测组分的量与响应值(峰高或峰面积)成正比✎由已知量的标样可求得定量校正因子✎定量校正因子:是定量计算公式中的比例常数,其物理意义是单位响应值(峰面积)所代表的被测组分的量✎测定未知组分的响应值,通过定量校正因子即可求得其含量液相色谱定量分析的基本步骤❀开发一个适合定量分析的色谱方法:确认被检测组分峰,并达到分
2、离度(R)大于1.5确定被测组分色谱峰的一致性确定方法的检测限及定量限;灵敏度及线性范围❀用不同浓度的标准样品建立校正曲线❀考查定量方法的准确度及精密度❀用M32色谱管理系统实施样品采集,数据处理及报告结果鉴别需定量的色谱峰(定性)❀定性鉴别每个要定量的色谱峰✎通过比较保留值(通常是保留时间)的方法,找到各色谱峰所对应的组份✎大多数情况下用与标样比较保留时间来定性❀即所谓：➀保留时间相同，可能是同样的组份➁保留时间不同，肯定不是同样的组份用保留时间定性❀用“标样”的保留值定出被测组份的位置0.40Ethylparaben0.
3、350.30Propylparaben0.25AU0.20Uracil0.150.100.050.000.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.00Minutes进一步的确认(定性)❀标准加入❀同时用其他方法✎其他色谱方法（改变机理，如：用不同的色谱柱）✎其他检测器➠PDA，光谱图比较、谱库检索➠MS，质谱图解析、谱库检索✎其他仪器方法标准加入法举例❀废水样品中五氯苯（PCP）的分析梯度曲线梯度曲线4ppm3ppm2ppmPCP1ppm确认定量峰的一致
4、性❀确认色谱峰的纯度✎保证每个色谱峰下只有一个被测的组份✎检查是否有共流出的物质（杂质）干扰❀色谱峰纯度确认的方法✎用光电二极管矩阵(PDA)检测器比较光谱图✎峰纯度鉴定,2487双波长RatioPlot✎996的纯度角理论色谱峰定性中常见问题❀鉴定色谱峰(定性)时常见问题如下:✎被鉴定峰丢失✎色谱图中出峰比预想的少✎色谱图中出峰比预想的多(鬼峰)色谱峰定性中常见问题分析❀被鉴定峰丢失✎保留时间改变✎数据处理系统中输入值不正确❀色谱图中出峰比预想的少✎样品分解✎色谱柱分辨率丧失✎用错流动相✎梯度洗脱时平衡不足(例如,过早将手
5、动进样器扳至(Load)位置色谱峰定性中常见问题分析(续)❀色谱图中出峰比预想的多(鬼峰):✎样品分解或制样时导入了杂质✎流动相被污染,或用错流动相✎流动相中含有稳定剂或稳定剂发生变化✎前次进样的后流出物(某些RT值特大的组分)✎进样器被污染,洗针系统出问题或注射器脏✎未充分平衡进样器Loop管✎保护柱脏,色谱柱被污染,分辨率下降HPLC定量分析的常用术语(1)❀样品(Sample):含有待测物,供色谱分析的溶液❀样品类型(SampleType)分为标样和未知两种:标样(Standard):浓度已知的纯品;未知样(Unkno
6、w):浓度待测的混合物❀样品量(SampleWeight):待测样品的原始称样量❀稀释度(Dilution):未知样品的稀释倍数❀组分(Componance):欲做定量分析的色谱峰,即含量未知的被测物❀组分的量(Amount):被测物质的含量(或浓度)HPLC定量分析的常用术语(2)❀积分(Integrity):由计算机对色谱峰进行峰面积测量的计算过程❀定量限:可以准确定量的样品最低量,一般要求色谱峰的S/N＞10:1❀校正曲线(CalibrationCurve):组分含量对响应值的线性曲线,由已知量的标准物建立,用于测定待
7、测物的未知含量常用的定量方法❀标准曲线法,分为外标法和内标法:❀外标法✎在液相色谱中用得最多❀内标法✎准确，但是麻烦✎在标准方法中用得最多外标法定量❀配制一系列已知浓度的标样储存标样工作标样01234增加溶质的浓度外标法定量（二）❀采集不同浓度0.300.300.30标样的色谱图0.250.250.250.200.200.20❀积分,按外标法0.150.150.15定量计算,建立0.100.100.100.050.050.050.000.000.00标准曲线0.000.501.001.502.002.503.003.504.
8、004.505.005.506.006.507.000.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.000.000.501.001.502.002.503.003.504.004.505.005.506.006.507.0
