转录因子Oct-4的SUMO化修饰

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1、中国科学院上海生命科学研究院健康科学研究所博士后学位论文转录因子Oct-4的SUMO化修饰姓名：张志宏申请学位级别：博士后专业：@指导教师：金颖20060901转录因子Oct-4的SUMO化修饰摘要胚胎干细胞(Embryonicstemcells，ESC)是从哺乳类动物着床前胚胎内细胞团中分离出来的能在体外长期培养的多能干细胞。它可以无限制自我更新并在一定条件下进行诱导分化成其它所有类型的细胞。胚胎干细胞的这些特点使得它基础研究和临床治疗领域都有重要的价值。然而，我们只有在分子水平阐明其发育全能性机制，在应用方面才会更加安全、有效。研究表明，POU家族转录因子oc“是影响胚胎干细

2、胞发育全能性建立和保持的关键因子。Oct-4特异表达于小鼠胚胎发育过程中的多能和全能性细胞，在胚胎干细胞、胚胎肿瘤细胞和胚胎生殖细胞等未分化的体外培养细胞中也高表达。胚胎干细胞中Oct-4的表达水平决定了其生长或分化方向：当Oct-4的表达水平高于正常的2倍时，ES细胞向原始内胚层与中胚层细胞方向分化；当Oct-4的表达水平低于正常的50％时，ES细胞则去分化为滋养层细胞：只有Oct-4维持在正常水平，ES细胞才能维持在自我更新状态。但目前调控Oct-4表达和功能的分子机制尚不清楚。由于体内的蛋白经常通过蛋白质之间的相互作用或形成复合体发挥作用，那么筛选与Oct-4相互作用的蛋白

3、可为揭示胚胎干细胞维持发育全能性的分子机制提供线索。我们构建了用于酵母双杂交筛选的ES细胞eDNA文库。利用Oct-4的PH结构域作为诱饵蛋白，我们筛选到一个可能与Oct-4相互作用的蛋I刍-Ubc9。Ubc9是SUMO化修饰通路中的E2(SUMO结合酶)，能催化SUMO结合到底物蛋白的赖氨酸上。GSTpulldown和免疫共沉淀实验证实Oct-4与Ubc9存在相互作用。在体外、体内条件下，Oct-4能被SUMO．1修饰。氨基酸突变实验显示，Oct-4的第118位的赖氨酸是SUMO．1结合的主要位点。分析野生型与SUMO．1结合位点突变的蛋白稳定性，发现SUMO．1位点突变可增强

4、蛋白的稳定性，表明SUMO．1修饰促使蛋白质不稳定。检测体外和体内野生与突变蛋白的泛素化水平，显示SUMO．1与泛素修饰可能不在同一位点，但SUMO．1修饰增强了泛素修饰的水平。在HEK293细胞中的荧光素酶报告基因实验中，SUMO．1位点突变后，Oct-4的转录活性明显增强。与在胚胎干细胞中的报告基因实验结果一致。这些结果表明SUMO．1修饰抑制了OCt-4的转录活性。我们首次证实了Oct-4能被SUMO．1修饰，SUMO．1修饰与泛素化修饰可能在翻译后修饰的水平上协同调节Oct-4的蛋白水平，使其保持在一个狭窄的范围内，从而维持胚胎干细胞的全能性。关键词Oct-4，Ubc9，

5、SUMO．1，SUMO化，胚胎干细胞2PoSTTRANSLATIoNALMoDIFICATIoNoFPoUDoM[AINTRANSCRⅡ．1’IoNALFACToRoCT_4BYSUMo．1ABSTRACTPOUdomaintranscriptionfactorOct-4playsacrucialroleinmaintainingself-renewalandpluripotencyofembryonicstemcells．Itisexpressedalmostexclusivelyintotipotentandpluripotentcellsduringmousedevelop

6、mentandalsopresentinculturedundifferentiatedembryocelllinesincludingEScells，embryonalcarcinomacellsandembryonicgermcells．Furthermore，quantitativeanalysisofOct-4expressionrevealedthatahighlevelofOct-4expressiondrivesEScellstowardstheextra-embryonicmesodermorendodermlineages，whilethosewithalowl

7、evelofOctMexpressionbecomestrophectodermalcells；EScellswithanormallevelofOct-4expressionremainpluripotent．However,themolecularmechanismcontrollingOct-4levelsinembryonicstemcellsremainslargelyunknown．ToexplorethemolecularmechanismregulatingOct