液相色谱基本理论培训

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1、液相色谱基本理论质量管理部液相组刘科强2011.08.03色谱分析方法的发展历史：1906年，俄国植物化学家Tswett首次提出色谱20世纪30年代后，出现了纸色谱离子交换色谱和薄层色谱1952年，英国Martin和Synge研究了气—液分配色谱1958年，Moore和stein研究了液相离子交换色谱，氨基酸色谱分析仪器出现20世纪60年代中后期，气相色谱理论和实践发现，液相色谱开始活跃20世纪70年代微处理机技术用于液相色谱，提高了自动化水平。20世纪90后，生物工程和生命科学的发展，为HPLC提出更多课题。21世纪后，生物大分子和手性化合物的分离和分析对HPLC

2、提出更高要求。色谱分析方法的特点:特点:HPLC的特点可以归结为“三高一广一快”。即高压，高效，高灵敏度;使用范围广；分析速度快。优点：可以用于高沸点，分子量大，难挥发的有机物质和有生物活性物质的分析和分离，分析速度快，灵敏度高，选择性好缺点：缺少通用型的检测器类型，不能用于有机物质的准确定性色谱分析方法的原理;原理：使混合物中个组分在两相间进行分配，其中一相是不动的，称为固定相；另一相是携带混合物流过此固定相的流体，称为流动相，当流动相中所含混合物经过固定相时，就会与固定相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，以及与固定相发生作用的大小，强弱也有差异。因此在同

3、一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后不同的次序从固定相中流出。色谱分析方法的两个理论依据：塔板理论（platetheory）理论假设：快速分配平衡；脉动式的进入；沿柱方向扩散；分配系数为一定值。解决的问题：色谱流出曲线方程：C=[C0/δ(2π)0.5]e-(t1-t2)/2δ可以导出n与色谱峰半峰宽度或峰底宽度的关系：n=5.54(tR/W1/2)2 =  16(tR/W)2优点：成功的解释了流出曲线的形状（呈正态分布），浓度极大点的位置以及计算评价柱效能的方法。缺点：不能解释塔板高度是受那些因素影响的本质问题不能解释为什么在不同的流

4、速下可以测得不同的理论塔板数速率理论（ratetheory）理论假设：由踏板理论和塔板高度的动力学因素构成。H=A+B/u+cU①涡流扩散项（多路径效应）：A=2λdpλ----填充物的不均匀性dp------填充物的平均颗粒直径实际意义：使A↓可使H↓→n=L/H→n↑塔板数上升可以提高柱效②分子扩散项（纵向扩散项）：B=2rDgr----因载体填充在柱内而引起的气体扩散路径弯曲的因数Dg----组分在气相中的扩散系数反比于再起相对分子量的平方根实际意义：M↑→Dg↓→(B/U)↓→n↑塔板数上升可以提高柱效③传质阻力项：C=Cg+ClCg----气相传质阻力项C

5、l----液相传质阻力项关于基线的3个概念基线：没有组分进入检测器时，反映检测器系统噪声随时间变化的线称为基线基线漂移：基线随时间的定向缓慢变化基线噪声:指由各种因素所引起的基线起伏关于保留时间6个概念（体积）死时间：不被固定相吸附或溶解的组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所要的时间保留时间：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的时间调整保留时间：扣除死时间的保留时间死体积：指填充柱管内固定相颗粒间所剩留的空间以及柱前和柱后连接头的空间总和保留体积：指被测组分从进样开始到柱后出现浓度最大值时所需要的流动相体积调整保留体积：扣除死体积的保留体积两个重要因

6、子选择因子α：某组分2的调整保留时间与另一个组分1的调整保留时间的比值α=r21=t’(2)/t’(1)容量因子κ：在一定的温度和压力下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的质量比κ=ms/mm一个系数分配系数K：在一定的温度下，在两相间达到分配平衡时，组分在两相间的浓度比K=Cs/Cm几个重要色谱数学表达式：分离度：R=[tR(2)-tR(1)]/0.5(Y1+Y2)色谱分离基本方程式:R=1/4n1/2[(a-1)/a][k/(1+k)]理论塔板数与板高度方程式:n=5.54(tR/Y1/2)2 =  16(tR/Y)2H=L/nHPLC构成和使用时的注意事项

7、1.流动相储液箱：主要用于流动相的存放。2.在线脱气机：主要用于流动相的脱气，防止在流动相中有溶解的气体以引起基线噪声的增加。3.比例阀：用于二元泵或四元泵的流动相中各组分的混合。4.高压泵：给流动相一个高压的推动力，使其通过色谱柱。5.进样器（六通进样阀）：将样品顺利的注入色谱系统。6.柱温箱：维持色谱柱的恒定温度，使一定的流动相粘度和压力降稳定，以获得稳定的保留时间，使其有良好的重现性。7.色谱柱：样品中个组分分离的主要场所。8.检测器：将样品中各组分的量转化为可检测的信号。（常用的是紫外检测器）HPLC色谱条件的优化：1.流动相的优化：HPLC要提高分离的