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1、中华人民共和国国家标准谷物和大豆中赭曲霉毒素AGB/T13111-91的测定方法MethodfordeterminationofochratoxinAincerealandbean━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━1主题内容与适用范围本标准规定了谷物和大豆中赭曲霉毒素A的薄层色谱测定方法。本标准适用于小麦、玉米和大豆中赭曲霉毒素A的测定。在薄层板上赭曲霉毒素A的最低检出量为4ng。本方法的最低检测量为10μg/kg。2原理用三氯甲烷-0.1mol/L磷酸或石油醚-甲醇/水提取样品中的赭曲霉毒素A，样品提取液经液-液分配后，根据其在365nm紫外光
2、灯下产生黄绿色荧光，在薄层色谱板上与标准比较测定含量。3试剂以下试剂除特殊规定外均为分析纯试剂，水为蒸馏水或同等纯度的水。3.1石油醚(60～90℃或30～60℃)。3.2甲醇。3.3三氯甲烷。3.4甲苯。3.5乙酸乙酯。3.8甲酸。3.7冰乙酸。3.8乙醚。3.9苯-乙腈(98：2)。3.100.1mol/L磷酸[c(H3PO4)=0.1mol/L]：称取11.5g磷酸(85%)加水稀释至1000mL。3.112mol/L盐酸溶液[c(HCL)=2mol/L]：量取20mL盐酸，加水稀释至120mL。3.124%氯化钠溶液。3.130.1mol/L碳酸氢钠溶液[c(NaHCO3)=0.1
3、mol/L]：称取8.4g碳酸氢钠,加适量水溶解，并用水稀释至1000mL。3.14硅胶G：薄层层析用。3.15赭曲霉毒素A(以下简称OA)标准溶液：用苯-冰乙酸(99：1)配成40μg/mL赭曲霉毒素A贮备液，并用紫外分光光度计测定其浓度。浓度的测定参照GB5009.22《食品中黄曲霉毒素B1的测定方法》中2.14条(赭曲霉毒素A的最大吸收峰波长333nm，分子量403，克分子消光系数值为5550)。精密吸取贮备液，用苯稀释成每毫升含赭曲霉毒素A0.5μg，赭曲霉毒素A标准液应置冰箱中避光保存。4仪器所有玻璃仪器均需用稀盐酸浸泡，用自来水，蒸馏水冲洗。4.1小型粉碎机。4.2电动振荡器。
4、4.3玻璃板：5cm×20cm。4.4薄层涂布器。4.5展开槽：内长25cm、宽6cm、高4cm。4.6紫外光灯：365nm。4.7微量注射器：10μL、50μL。4.8具0.2mL尾管的10mL，小浓缩瓶。5分析步骤5.1提取5.1.1甲法称取20g粉碎并通过20目筛的样品，置于200mL具塞锥形瓶中，加入100mL三氯甲烷和10mL0.1mol/L磷酸，振荡30min后通过快速定性滤纸过滤；取20ml，滤液置于250mL分液漏斗中,加50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液振摇2min,静置分层后，将三氯甲烷层放入另一个100mL分液漏斗中(少量乳化层，或即使三氯甲烷层全部乳化都可放入分液
5、漏斗中)，加入50mL0.1mol/L碳酸氢钠溶液重复提取三氯甲烷层,静置分层后弃去三氯甲烷层(如三氯甲烷层仍乳化,弃去,不影响结果)。碳酸氢钠水层并入第一个分液漏斗中,加约5.5mL2mol/L盐酸溶液调节pH2～3(用pH试纸测试)，加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后,放三氯甲烷层于另一盛有100mL水的250mL分液漏斗中,酸水层再用10mL三氯甲烷振摇、提取、静置，将三氯甲烷层并入同一分液漏斗中。振摇、静置分层,用脱脂棉擦干分液漏斗下端，放三氯甲烷层于一75ml蒸发皿中，将蒸发皿置蒸汽浴上通风挥干。用约8mL三氯甲烷分次将蒸发皿中的残渣溶解，转入具尾管的10mL浓缩瓶中,
6、置80℃水浴锅上用蒸汽加热吹氮气(N2),浓缩至干,加入0.2mL苯-乙腈(98：2)溶解残渣,摇匀,供薄层色谱点样用。5.1.2乙法称取20g粉碎并通过20目筛的样品加于200mL具塞锥形瓶中,加30mL石油醚和100mL甲醇-水(55：45)，在瓶塞上抹上一层水盖严防漏。振荡30min后，通过快速定性滤纸滤入分液漏斗中，待下层甲醇水层分清后，取出20mL滤液置于100mL分液漏斗中,用pH试纸测试,一般为pH5～6。加入25mL三氯甲烷振摇2min，静置分层后放出三氯甲烷层于另一分液漏斗中，再用10mL三氯甲烷重复振摇提取甲醇-水层(在用三氯甲烷振摇提取时，如发生乳化现象，可滴加甲醇促
7、使其分层)，将三氯甲烷层合并于同一分液漏斗中，加入50～100mL4%氯化钠溶液(加入量视品种不同而异，大豆加100mL，小麦、玉米则加50mL左右)，振摇放置(如为大豆样品提取液还须轻轻反复倒转分液漏斗，使乳化层逐渐上升。如乳化严重可加入少许甲醇),待三氯甲烷层澄清后,用脱脂棉擦干分液漏斗下端,放三氯甲烷层于75mL蒸发皿中(如为大豆样品须再加入10mL三氯甲烷振摇，三氯甲烷层合并于同一蒸发皿中)，将蒸发皿置蒸汽浴上通
