式细胞术系列之-dna倍体和细胞周期分析

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1、DNA倍体和细胞周期分析细胞周期和DNA倍体分析的原理G0/G1期DNA含量为2CS期细胞,DNA含量开始增加,>2CG2/M期细胞,DNA含量开始增加至4C1、正常细胞DNA含量稳定在2C水平2、性细胞DNA含量为1C3、处于增殖期至分裂期细胞由2C增加至4C4、凋亡细胞DNA断裂,含量<2C细胞经荧光染料(碘化丙啶，PI)染色，用流式细胞仪测定细胞DNA含量，可得到细胞周期三个时相(G0/G1、S和G2/M期)的DNA含量（％），可以反映细胞的增殖状态和非二倍体（异倍体）的DNA含量Diploid:100.00%DipG1:54.38%at46.90DipG2:15.91%at9

2、1.61DipS:29.71%G2/G1:1.95%CV:5.23G0/G1SG2/MDNA检测的常用术语表示流式分析中DNA含量的分辨率或精确度。通常由G0/G1峰的CV来反映【%CV=（SD/mean）x100】。影响CV的因素主要包括两方面：仪器因素（如液流、光路、机器调试等）和样本制备及染色过程对标本的人为影响。1.变异系数（CoefficientofVariation，CV）DI指的是肿瘤样本G0/G1峰的平均道数与人正常二倍体G0/G1峰的平均道数之间的比值。DI为1意味着二倍体（2c）（一般正常范围为0.9~1.1）。倍体（Ploidy）：原指染色体数目。流式中用来描述

3、总的DNA含量。二倍体细胞有正常细胞的DNA含量但不除外染色体异常。DI为1.9-2.1的细胞为四倍体（CV为5%时）。在二倍体和四倍体区域之外的统称异倍体。2.DNA指数（DNAindex，DI）和倍体（Ploidy）DNA检测的常用术语Diploid:64.50%DipG1:92.45%at49.24DipG2:2.30%at98.48DipS:5.26%G2/G1:2.00%CV:3.21Aneuploid1:35.50%An1G1:97.69%at58.53An1G2:0.00%at123.89An1S:2.31%G2/G1:2.12%CV:3.14DI:1.19可检测标本新

4、鲜的血液、骨髓、体液、灌洗液、手术活检、细针穿刺物等。冰冻或固定（酒精或甲醛）保存的组织常规固定/包埋用于组织检查的样本（蜡块）。通常最好的结果来自新鲜或冰冻的标本。蜡块包埋的标本需进行特殊处理DNA异倍体染色操作程序（BD公司试剂盒Cat.No.340242）A液：含有胰蛋白酶、四氢氯化精胺去污剂，可用于分离实体组织，消化细胞膜及细胞骨架。B液：含有胰蛋白酶抑制剂、RNA酶、柠檬酸盐缓冲液、四氢氯化精胺。用于抑制胰蛋白酶的作用并消化RNA。C液：含有PI染液、四氢氯化精胺、柠檬酸盐缓冲液。PI作用时的最终浓度至少有125ug/ml缓冲液含有柠檬酸钠、DMSO，用于收集和（或）冷冻细

5、胞悬液。1、试剂盒组成：（1）血液或骨髓：取全血100微升或骨髓50微升，加FACSLysing溶血液1ml，置室温10min,1500rmp离心5min，弃上清，生理盐水2ml洗涤细胞2次。然后，可以直接按试剂盒说明书进行染色；也可用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放。（2）胸水、腹水等组织液：取适量液体，1500rmp离心5min，弃上清液，获取细胞（如混有过多的红细胞，可以用FACSLysing溶血液进行溶血），同上处理。（3）固体组织：小块组织，可以放入200目尼龙网袋中，用注射器针芯碾磨；大的组织块，可用剪刀将组织剪为肉糜状，加适量生理盐水，置试管中，垂直放置数分钟，待大块组

6、织下沉后，吸取上层细胞悬液，生理盐水2ml洗涤细胞2次。直接进行染色，或用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放。标本处理将上述处理的细胞（约5~10×105）悬起，加A液250微升，轻轻混匀，置室温10min。加B液200微升，轻轻混匀，置室温10min。加C液200微升，轻轻混匀，置室温，避光10min。200目尼龙网过滤到相应的流式管。2小时内上机检测。染色过程注意事项1、需较长时间存放的标本可用冰冷的70%乙醇固定，4°C存放；2、一般组织或体液均为混合细胞成分，含有一定量的二倍体细胞，可以作为内参照。如分析的细胞来自纯肿瘤组织，应加入一定量的正常PBMC做二倍体对照；3、每次分析

7、前，用DNA质量控制试剂盒（如BD公司，CatalogNo:349523），检测和评价仪器性能（如线性度、CV等）；4、收集细胞用低速，应保证速度小于1000/秒，每个标本收取30000个细胞进行分析。流式数据收集1.流式细胞仪校准与设置：打开仪器专用校准软件（如FACSComp)，用标准荧光微球（如CaliBRITE)进行校准；在数据获取分析软件（如CellQuest)中，将FSC、SSC、FL2设为线性放大（Lin），DDMParam设为FL2。2.荧