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1、第十四章.组化和免疫组化染色结果的定量测定(TheQuantitationAssayofHistochemistry&ImmunohistochemistryStaining)将组化,免疫组化和原位杂交等的染色结果分析提高到定量水平.最常用的有图像分析术(Imageanalysistechnique),显微分光光度术(Microspectrophotometrytechnique),流式细胞术,(Techniqueofflowcytometry,FCM)和激光扫描共聚焦显微镜术(Techniqueoflase
2、rscanningconfocalmicroscopy,LSCM)等.1I.图像分析术A.目测半定量:依据反应产物的面积和颜色深浅,主观性大.B.图像分析仪(Imageanalyzer):又称图像分析系统.1.主要结构和工作原理:a.显微镜:获取染色结果的光学信息.b.图像输入装置:摄像机或扫描器,将光学信息输入电脑.c.电脑:将光学信息转换成电子信息.将光学信号的灰度分为256级可发现染色深浅的微小差别.彩色有两种:真彩色(Realcolor)是指标本染色的真实颜色,而假彩色(Pseudocolor)是指将
3、不同灰度转换成不同的颜色以增强对比度.d.输出装置:显示器或打印机等给出图象表面几何形状测量(体积/面积/表面积/长度等)和图象密度测量(数目)等客观数据.22.应用:定量给出组织细胞形态的几何参数和组织结构(包括宏观和微观)的特征性参数,从平面测量推算到空间参数和组织结构的三维图像重建.3.注意事项:a.照片高质量高倍.对照组照片的放大倍数应相同.b.复染会影响灰度值的准确性.c.必要时要进行图像的加工处理,如阳性区选择和图像切割等.3左侧睾丸和附睾体部精子结合抗原蛋白异构体11(SPAG11E)免疫组化染
4、色.西安交通大学医学院解剖与组胚专业博士生田宏.2010.左侧睾丸:A.左侧假手术对照组;B.精索静脉曲张(ELV)2周组周;C.ELV4周.附睾体部:D.左侧假手术对照组;E.ELV2周;F.ELV4周.4ELV大鼠睾丸和附睾SPAG11E免疫组化灰度值测定结果:睾丸:ELV2周和4周组SPAG11E蛋白的平均灰度值与其相应的对照组比较未见明显改变(P>0.05);附睾:ELV2周和4周组SPAG11E蛋白的表达均较同期对照组显著减弱(P<0.05或P<0.01),ELV4周组附睾SPAG11E蛋白的表达较
5、ELV2周组显著减弱(P<0.01).5II.显微分光光度术A.简介:细胞分光光度计(cytospectrophotometer),是一种以物质分子对光波的选择性吸收为基础,对生物样品中的化学物质进行定量测定的精密仪器.通过测定核酸,蛋白质,脂类,酶类或其它化学成分的光吸收和微区面积而计算它们的相对含量.B.主要结构和工作原理:1.光源:有白炽灯和汞灯,疝灯.白炽灯可作为标准光源,辐射光谱在400~700nm间,用于一般测量.汞灯为激发荧光的理想光源,疝灯的辐射光谱在250~1100nm间.2.单色器和滤光片
6、:保证进入显微镜的光波亮度充足,波长单一且可调.3.光电组合件:将测量区内的光学信号转变为电子信号,产生测量数据.6C.基本步骤:1.标本制备:凡是显示细胞内化学物质的各种组化和免疫组化染色标本均可用显微分光光度计对单个细胞进行定量测定,但标本内不能有双重染色且染色要保持均匀一致.72.测量方法:a.单波长法:用一种波长的光测量,所测物质分布如果是均匀的,因此测量法所得数值,其误差就小.b.扫描测量法:能够消除由于吸光物质分布不均匀而造成的分布误差,和由于面积不规则造成的面积测量误差.扫描法的原理是通过积分的
7、方法,虽然被测物质分布不均匀,但可以将被测物质的面积分成许多小区,将各个小区的数值相加.c.荧光光度法:凡被测物质能产生荧光(原发荧光,诱发荧光,荧光或免疫荧光标记)的都可以应用荧光光度法测定.广泛用于测定细胞内的核酸(DNA和RNA),氨基酸,蛋白质,糖原,生物胺,抗体和酶的相对含量.D.应用范围:对细胞的DNA,RNA,蛋白质,酶,糖,脂等大分子物质以及免疫活性物质等都能定性,定位和定量测定.8III.流式细胞术A.简介:可对单个细胞逐个地进行高速准确的定量分析和分类,每秒测定达数千万个细胞,且有高度的重
8、复性.在单个细胞中,可同时测得DNA,RNA及细胞体积3个参数,也可测定核与细胞的比例,蛋白质和免疫标记的其它参量.B.主要结构和工作原理:1.液流系统:先制备荧光等染色的单细胞悬液,放入样品管中,使其在气体压力下进入流动室;流动室内充满鞘液,在鞘液的约束下,细胞排列成单行,由流动室的喷嘴喷出,成为细胞柱液,依次恒速通过测量区.2.激发光器件:在测量区内发射波长可调的激光柱,垂直照射细胞液柱,细胞受
