植化方法学1 沈阳药科大学天然药物化学教研室

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1、植化方法学天然药物化学教研室邱峰2010年4月植化方法学（一）（各种色谱的分离原理及操作方法）一、硅胶相关色谱二、氧化铝相关色谱三、聚酰胺柱色谱四、葡聚糖凝胶柱色谱五、大孔吸附柱色谱六、离子交换柱色谱七、反应薄层一、硅胶相关色谱1、硅胶的结构(SiO2.XH2O)2、分离原理吸附作用：氢键作用、偶极作用和静电作用等吸附强度的大小取决于硅醇基类型、硅醇基数目（比表面积）、孔体积、平均孔径O—Si—O—Si—OHOOOO3、使用范围由于硅胶的弱酸性、往往适合于分离黄酮、香豆素、蒽醌、萜、甾体等中性或弱酸性类化合物。黄连生物碱的化学结构薄层

2、板：硅胶G薄层板，110C活化1小时展开剂：乙酸乙酯-氯仿-甲醇-浓氨水-二乙胺（8:2:2:1:0.5）检测方式：UV366nm黄连生物碱硅胶薄层层析图谱4、常用硅胶的规格100~140目、100~200目（75~150m）、200~300目（45~75m）为柱层析硅胶10~40m为薄层层析硅胶2~10m为高效薄层或液相色谱硅胶5、薄层层析硅胶的种类硅胶G:含有石膏12~14%，粒度10~40m，pH6~7(10%)。硅胶H:不含石膏，pH6~7(10%)。硅胶GF254:含有石膏12~14%，pH6~7(10%)，且含

3、有少量的荧光剂。6、硅胶含水量与活性之间的关系细玻璃管法测定硅胶活性展开剂：苯7、含水硅胶色谱硅胶含水达17%以上为分配色谱，适宜分离生物碱、糖类、皂苷、有机酸等。表现在薄层和开放柱上，展开剂或洗脱剂为多相含水系统。薄层板：硅胶H展开剂：I:正丁醇-乙酸乙酯-水（4:1:1）II:氯仿-甲醇-水（65:35:10）下层显色：10%硫酸红参中人参皂苷的薄层色谱图8、硅胶制备薄层操作方法1)、薄层的制备2020cm2的玻璃板一般所用硅胶量为8~20g，5‰CMCNa的用量按1:2~2.5为宜，晾干，根据需要可进行活化。2)、点样（10~

4、50mg）用玻璃毛细管或移液管将样品溶液线形点样于硅胶板上，点样线宽度要适宜，过窄易超载，过宽影响分离效果。3)、展开晾干点样处溶剂后，以选好的展开剂进行展开，对有些化合物预饱和一段时间，分离效果更好。原点前沿4)、标记色带取出薄层板，晾干，根据荧光画出色带，或部分显色确定色带的位置。5)、剥离、提取剥离色带部分的硅胶，以合适的溶剂直接提取或装入小玻璃柱进行洗脱。（忌用含水系统处理）6)、浓缩浓缩提取液或洗脱液得色带对应的化合物。多数情况下，需要进一步的精制或纯化处理。8、制备薄层的操作原点前沿制备薄层展开后的后处理9、硅胶柱层析的操

5、作（开放柱）1)、拌样（干法上样）：将分离样品溶于易挥散溶剂中，与三倍量的柱层析硅胶拌样。滴加样品溶液的同时应不断搅拌均匀，一旦达到制剂软材程度应停止滴加样品溶液，晾干或低温干燥（注意有毒溶剂的处理）后再继续操作，直到样品溶液全部加入。2)、装柱：将拌样硅胶10~20倍量的柱层析硅胶浸泡于起始溶剂中，搅拌赶出气泡，装入准备好的玻璃柱中，平衡至不再下降为止。3)、上样：待硅胶柱平衡好后，将干燥好的拌样硅胶用漏斗加入柱子上部（加入前要保证起始溶剂在柱子中足够的高度以免带入气泡）。4)、加入保护硅胶或棉花：用起始溶剂洗脱至柱中上端溶剂颜色变

6、浅或无色为止，然后加入适量硅胶或棉花起缓冲作用。5)、柱层析洗脱剂的选择起始溶剂原则上对被分离样品中的任何物质都没有洗脱能力。洗脱溶剂的选择以硅胶薄层板的层析行为为指导，被分离成分的Rf值一般在0.1~0.2为宜（理论上为0.2~0.3）。“注”：展开剂和洗脱剂的选择最好参考文献资料。6)、更换洗脱剂在一个洗脱剂系统下，一般要求至少洗脱3~5个保留体积，实验中可根据具体情况决定是否更换，比如到5个保留体积还有较大量的的物质被洗脱下来，就应当继续洗脱下去。7)、保留体积的估算浸泡硅胶的溶剂量+空柱溶剂量–洗脱下来的溶剂量=保留体积8)、

7、流速的提高：柱上端加压或下段流出口减压，特别是填料硅胶粒度小时可采用这两种方式加快洗脱速度。9)、合并相同流份：硅胶薄层指导合并，流份体积根据硅胶柱大小和分离样品量确定。10、硅胶中低压柱色谱及高效液相色谱1)、流动相的选择：通过硅胶薄层摸索液相色谱条件，最好用高效薄层指导来选择流动相，其粒度接近于中低压柱填料的粒度，用自制的硅胶薄层选择流动相时注意粒度和含有水分的影响。另外也可用同类型填料的分析柱摸索流动相条件。2)、样品溶液的处理：尽可能选择流动相溶解样品，并用微孔过滤器过滤。选择极性大于流动相的溶剂配制样品溶液会因进样量的不同影

8、响保留时间和分离效果。3)、检测器的选择：有紫外吸收的物质尽可能用紫外检测器，无紫外吸收的或紫外吸收较弱的可选用示差检测器。目前出现的蒸发光散射检测器则是对几乎所有的非挥发性天然化合物适用。11、硅胶干柱法（适用于有颜色