研究生基本实验技能培训

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1、研究生科研实验教学基地建设基本实验技能培训首都医科大学附属北京朝阳医院基础医学研究中心·梁燕85231624,liangyan1990@shou.com主要内容1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项1.1基因组DNA提取原理既要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等分离，又要保持DNA分子的完整。仪器准备：台式离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、移液

2、器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架试剂准备：试剂盒、无水乙醇等1.2基因组DNA提取试剂盒试剂盒内容操作步骤（重点）向52ml的缓冲液GD中加入68ml无水乙醇，并标记；向50ml的缓冲液PW中加入200ml无水乙醇，并标记；取200ul全血，加入20ul的蛋白酶K溶液，混匀；加入200ul缓冲液GB，充分颠倒混匀，56℃放置10分钟，期间颠倒混匀数次，溶液应变清亮。加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀。将吸附柱CB3放入收集管中准备好，将上述溶液移到吸附柱CB3中，12000r

3、pm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；如果步骤5的溶液不能一次加完，可以再次重复步骤6；向吸附柱中加500ul的缓冲液GD，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；操作步骤（重点）7.向吸附柱中加入700ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；向吸附柱中加入500ul漂洗液PW，12000rpm离心30秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管；将吸附柱和收集管再次离心，12000rpm离心2分钟，将吸附柱至于室温放置数分钟；将吸附柱转

4、入一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50-200ul洗脱缓冲液TB，室温放置2-5分钟，12000rpm离心2分钟，将溶液收集到离心管中；测OD值，计算DNA浓度和纯度；或电泳估计DNA浓度。计算公式：OD260/OD280=1.7-1.9DNA浓度(ug/ul)=OD260×50×稀释倍数/1000OD260=0.1稀释倍数=250DNA浓度=0.1×50×250/1000=1.25ug/ul操作注意事项避免样品反复冻融56℃水浴摇匀可消除GB中的沉淀使用台式离心机，室温离心2.PCRPCR体系和循环条件PCR操

5、作步骤操作注意事项仪器准备：PCR仪，微型离心机、移液器、离心管（灭菌）、吸头（灭菌）、镊子（灭菌）、离心管架试剂准备：ddH2O,PCRBuffer，dNTP，引物，PCR聚合酶，DNA模板2.1PCR体系和循环条件（重点）BclIPCRTotalvolume25ul*2ddH2O16.5ul33ul10×Buffer2.5ul5uldNTP(25mM)2ul4ulPrimerF(10mM)1ul2ulPrimerR(10mM)1ul2ulExTaq(1U/ul)1ul2ulSum24ul48ul48/2=24ulTemp

6、lateDNA（0.1ug/ul)1ul1ul60℃，30s72℃，30s95℃，30s95℃，30s（预变性）72℃，30s（后延伸）30cycles2.2PCR操作步骤（重点）计算好所需扩增的PCR体系；打开PCR仪预热，设置PCR循环条件；准备试剂，融化，离心，置于冰上，备用；按顺序加样，混匀，离心，分装；加入模板DNA，混匀，离心；放入PCR仪，Start。2.3PCR操作注意事项避免试剂反复冻融计算总量，顺序加样更换吸头，避免污染3.琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳原理电泳方法步骤操作注意事项3.1琼脂糖凝胶电泳原理DNA分

7、子带负电荷，在直流电场中由负极移向正极；其移动速度与线性DNA片段长度成反比。配置1%的胶：称1g琼脂糖于适当大小三角瓶中，倒入100ml的1*TAE，微波炉加热至完全融化；待凝胶温度降至50-60度时，加入1ul的EB（10mg/ml)，摇匀，将胶倒入放好梳子的电泳板中，自然冷却30-60分钟；轻轻拔掉梳子，将胶放入电泳槽中，倒入1*TAE，没过加样孔；按照1ul上样Buffer+5ul的DNA混合后，点样；每排留一个孔加DNAmarker；100V电泳30分钟，凝胶成像仪照相。3.2琼脂糖凝胶电泳方法（重点）3.3电泳操

8、作注意事项带手套操作EB凝胶冷却时间至少30分钟凝胶完全融化MII-3II-2II-1I-2I-10应用BclI/RFLP多态位点进行基因连锁分析374211163小结1.DNA的提取DNA提取原理DNA提取方法操作注意事项2.PCRPCR体系和循环条件PCR操作步骤操作注意事项3.琼脂糖