微生物优良菌种的选育

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1、第四章微生物优良菌种的选育微生物发酵的一般流程种子扩大培养培养基配制空气除菌培养基灭菌发酵生产下游处理发酵设备提纲微生物优良生产菌种的特征自然突变选育诱变选育原理基本方法杂交育种细菌放线菌霉菌酵母菌原生质体融合基因工程技术基因表达系统利用大肠杆菌的基因表达系统利用酵母菌的基因表达系统基因工程菌的稳定性优良菌种应具备的特征对菌种的要求天然菌种的生产性能较低，一般需要进行选育。1.生产力：能在廉价的培养基上迅速生长，所需的代谢产物的产量高，其它代谢产物少2.操作性：培养条件简单，发酵易控制，产品易分离3.稳定性：抗噬菌体能力强，菌种纯，不易变异退

2、化4.安全性：是非病源菌，不产有害生物活性物质或毒素优良菌种应具备的特征选择生产菌种应注意的因素1.原料方面：广，转化率高；2.产物方面：目的产物含量高，副产物少；3.菌体方面：生长快、繁殖力强，耐受力强，抗污染、抗噬菌体能力强，遗传特性稳定4.设备方面：产泡沫少，适宜大罐生产。（培养条件异，周期短，需氧量小，抗污染能力强）一、自然选育利用微生物自然突变进行的菌种选育。原因：多因素低剂量的诱变效应；互变异构效应结果：负变大于正变，应经常分离纯化方法：菌悬液→平板分离→上摇瓶→检测→选种→保藏优点：简单易行，可与生产同步进行。缺点：频率低，10-

3、8—10-9/次分裂。二、诱变选育诱导微生物发生突变进行的菌种选育，包括诱变和筛选两个步骤。原理：染色体畸变；基因突变。影响诱变的因素：出发菌株（有一定生产能力，形态、生理强壮）；诱变剂的种类（单一或复合）与剂量（不宜过高和过低，致死率：70-80％）。诱变剂：能提高基因突变频率的物理、化学、生物因子。筛选比诱变更重要。筛选的方法：通过选择/鉴别培养基加以识别。初筛→复筛→确定最佳发酵条件（负变多，正变少）１、营养缺陷型突变株筛选酶缺陷，结果造成中间产物积累；解除协同反馈，使另一分支末端产物积累；渗漏型突变（酶未完全丧失活性，下降），末端产物少

4、，中间产物积累。２、抗反馈阻遏和抗反馈抑制突变株筛选调节基因或操纵基因突变，产生的阻遏蛋白与终产物不能结合或结合；结合，但不发生作用；结构基因突变，使结构酶无结合能力但有催化活性；方法：末端产物结构类似物筛选；（未突变者死，突变为抗者，生并产菌落）营养缺陷型回复突变株筛选。（活性复，结构改变）３、组成型突变株筛选诱导型依赖诱导物。组成型不依赖诱导物。突变发生在调节基因或操纵基因,解除对诱导物的依赖,可获组成型突变株。筛选方法：设计条件使组成型优势生长，或通过菌落分辨。①加诱导酶合成抑制物②交替培养法③显色反应法筛选方法①加诱导酶合成抑制物如：

5、加邻硝基-β-D-岩藻糖苷，抑制-β半乳糖苷酶合成。诱导型不能利用乳糖，不长；组成型产酶，能利用乳糖，生长，被富集。②交替培养法含诱导物（乳糖）中培养——组成型快——不含诱导物（葡萄糖）中培养——诱导型失酶——反复。③显色反应法不含诱导物平板培养——加底物——分解（有颜色变化）——检出。４.抗（敏感）性突变株筛选包括：抗生素、金属离子、温度、噬菌体①抗生素抗性突变：提高产量；②抗噬菌体突变：消除噬菌体污染；（与噬菌体存在与否无关）③条件抗性突变：如温度，可提高产量；（温度敏感突变，高温呈营养缺陷表型）④物敏突变：如：氟乙酸抑制顺乌头酸酶，氟乙酸

6、敏感突变型，顺乌头酸酶活性极低，更敏感，异柠檬酸产量少，柠檬酸积累。三、杂交育种长期诱变会使菌种生活能力下降。借助有性重组，使不同菌株的遗传物质得以交换（获优良性状集中的重组体）。1.细菌的杂交育种方法：转化、转导、F因子转导、R因子转移、接合。获部分合子。出发菌株需带遗传标记：营养缺陷、抗生素抗性、温敏、发酵性能２、放线菌的杂交育种基因重组过程近似细菌，育种方法与霉菌相似．放线菌的遗传体系和杂交原理：异核现象：同一细胞（菌丝）含不同基因型的核。无重组体出现。接合现象：发生部分染色体转移（交换），形成部分合子。整+部分、部分+部分。异核系的形成

7、：部分合子产生的无性繁殖系。能在基本或选择培养基上生长。（单交换，二体区）重组体的形成：异核系不稳定，可经过双交换形成重组子，产生重组子孢子。放线菌的杂交方法混合培养法：两互补缺陷型亲株混合培养，制孢子悬液，选择性平板分离。平板杂交法：一亲株培养，形成孢子，影印至已分别铺有另几种孢子的平板上，获孢子后再影印至选择平板上。玻璃纸转移法：两亲本需要双标记，混合带纸培养，未长气生菌丝时，纸移至一选择平板，获异核系。解剖镜下，小针收集小菌丝，于完全平板涂布，获分离子。３、霉菌的杂交育种准性生殖过程：不通过有性生殖的基因重组过程．异核体的形成：两不同性状

8、细胞（菌丝）连接，导致一细胞存在两个不同遗传型核。杂合二倍体形成；异核体偶尔发生不同核的融合，形成杂合核，为双倍体。菌丝成斑点、扇面——扇变。体细胞重