微生物菌种选育

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1、第二章菌种选育本章主要内容第一节菌种的分离筛选第二节菌种选育第三节生产菌种的扩大培养第四节菌种的保藏与复壮第一节菌种的分离筛选一、菌种的来源根据资料直接向有科研单位、高等院校、工厂或菌种保藏部门索取或购买；从大自然中分离筛选新的微生物菌种。二、分离思路新菌种的分离是要从混杂的各类微生物中依照生产的要求、菌种的特性，采用各种筛选方法，快速、准确地把所需要的菌种挑选出来。实验室或生产用菌种若不慎污染了杂菌，也必须重新进行分离纯化。有了优良的菌种，还要有合适的工艺条件和合理先进的设备与之配合。定方案：

2、首先要查阅资料，了解所需菌种的生长培养特性。采样：有针对性地采集样品。增殖：人为地通过控制养分或培条件，使所需菌种增殖培养后，在数量上占优势。分离筛选：采用选择性培养基利用分离技术得到纯种目的菌。发酵性能测定：进行生产性能测定。这些特性包括形态、培养特征、营养要求、生理生化特性、发酵周期、产品品种和产量、耐受最高温度、生长和发酵最适温度、最适pH值、提取工艺等。三、新种分离与筛选的步骤（一）采样1、采样对象以采集土壤为主。一般园田土和耕作过的沼泽土中，以细菌和放线菌为主，富含碳水化合物的土壤和沼

3、泽地中，酵母和霉菌较多，如一些野果生长区和果园内。采样的对象也可以是植物，腐败物品，某些水域等。从自然界筛选2、采样季节：以温度适中，雨量不多的秋初为好。3、采土方式：在选好适当地点后，用小萨子除去表土，取离地面5-15cm处的土约10g，盛入清洁的牛皮纸袋或塑料袋中，扎好，标记，记录采样时间、地点、环境条件等，以备查考。为了使土样中微生物的数量和类型尽少变化，宜将样品逐步分批寄回，以便及时分离。采取土壤样品要考虑的几个问题土质肥，微生物含量高，特别肥沃的土壤中细菌多，放线菌少；在植物残体枯枝落

4、叶下的土壤中较多含有拮抗性真菌。离地面5~20cm处的土壤通气良好、不受阳光直射，含菌量最高。采土季节以春秋两季最好。采土方法：选择适当地点、铲除表土、取土样数十克，盛入事先准备的无菌防水纸袋中，其上记录采土时间、地点、植被情况等。多点采土、混合分离，可以代表每一地块上的微生物分布平均情况（二）增殖培养含有目的菌较多的土样不需要富集培养如果原有样品中目的菌含量低，可以人为地添加相应的基质，培养使之以较其它微生物更快的速度生长繁殖，从而提高它们在样品中的比例，便于分离。富集培养的一般方法：采用有利

5、于目的菌种而不利于无关微生物的营养和培养条件，以达到使目的菌种在群体中比例上升的目的。例如碳源利用的控制，可选定糖，淀粉、纤维素，或者石油等，以其中的一种为唯一碳源，那么只有利用这一碳源的微生物才能大量正常生长，而其它微生物就可能死亡或淘汰。这样对下阶段的纯种分离就会顺利得多。一些有特定物质产生能力的菌种，不容易富集，只有通过大量艰苦的工作筛选取得。某些细菌的富集条件富集对象接种菌样添加营养物(g)特殊培养条件好氧氨基酸氧化菌土壤–好氧，pH7.0好氧性芽孢杆菌土壤，巴氏消毒–好氧，pH7.0氨

6、基酸发酵性梭菌土壤，巴氏消毒–厌氧，pH7.0耐碱解尿素芽孢菌土壤，巴氏消毒尿素50好氧，pH8.6厌氧八叠球菌土壤葡萄糖20厌氧，pH2~3乳酸菌植物体或牛奶葡萄糖20厌氧，pH6.5肠道细菌土壤或污水葡萄糖20，CaCO320好氧或厌氧，pH7.0丙酸菌干酪乳酸钠20厌氧，pH7.0醋酸菌果实或生啤酒乙醇40好氧，pH6.0注：培养基成分为酵母膏10g，KH2PO4或K2HPO41.0g，MgSO4·7H2O0.2g，加水1000ml。一般培养在30℃下。（三）培养分离尽管通过增殖培养效果显

7、著，但还是处于微生物的混杂生长状态。因此还必须分离，纯化。在这—步，增殖培养的选择性控制条件还应进一步应用，而且控制得细一点，好一点。纯种分离的方法有划线分离法、稀释分离法。稀释分离法稀释倒平板法平板涂布法注意：必须要做多个浓度的稀释分离平板。划线分离法——平板划线法（四）筛选1、初筛：从分离得到的大量微生物中，将目标微生物筛选出来的过程。常用的初选方法：水解酶产生菌的筛选：将酶的作用底物加在培养基中，接种后适温培养，根据菌苔周围是否产生水解圈筛选出水解酶产生菌。一般采用平板筛选。拮抗菌的筛选—

8、对峙培养：将病原指示菌与待测菌株相对接种在平板上适温培养，根据病原菌的生长情况筛选出拮抗性菌株。分初筛、复筛。2）摇瓶发酵筛选：将待测菌株进行液体振荡培养，取发酵滤液进行活力测定。2、复筛：在初筛的基础上，进一步鉴定有希望菌株的生产能力强弱的过程。复筛采用摇瓶培养后，发酵液采用精确的分析方法进行测定。复筛过程中，要结合培养条件进行。培养条件包括：培养基pH值发酵温度供氧量等。（五）菌种鉴定经典分类鉴定方法：形态特征、生理生化特征、血清学试验等。现代分类鉴定方法：遗传特性、细胞化学组分、计算机数值