液相色谱和毛细管电泳

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1、15-1概述高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代末70年代初发展起来的一种新型分离分析技术，随着不断改进与发展，目前已成为应用极为广泛的化学分离分析的重要手段。第15章高效液相色谱法液相色谱法最初是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法高效液相色谱法(HighperformanceLiquidChromatography，HPLC)在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱理论而发展起来的分离分析方法与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，引起高阻力，需用高压输送流动相，

2、故又称高压液相色谱法(HighPressureLiquidChromatography，HPLC)又因分析速度快而称为高速液相色谱法(HighSpeedLiquidChromatography，HSLC)，也称现代液相色谱15-1-1高效液相色谱法HPLC与经典液相色谱相比有以下优点：速度快：通常分析一个样品在15～30min，有些样品甚至在5min内即可完成分辨率高：可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果灵敏度高：紫外检测器可达0.01ng，荧光和电化学检测器可达0.1pg柱子可反复使用：用一根色谱柱可分离不

3、同的化合物样品量少，容易回收：样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备液相色谱的发展过程液相色谱法的分离原理是：溶于流动相中的各组分经过固定相时，由于与固定相发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。又称为色层法、层析法。15-1-2液相色谱分离原理样品形态：液体气体或液体(加热气化)流动相:液体(黏度大，102倍)气体(黏度小)输送压力：5-50MPa0.1-0.5MPa固定相：粒度5-10μm粒度0.1-0.5mm柱长:10-25

4、cm1-4m(填)10-100m(开)检测器：紫外TCD示差折光FID荧光ECD电化学FPD应用范围：高沸点低沸点热不稳定（活性）永久性气体强极性、大分子裂解产物15-1-3液相色谱与气相色谱的比较高压输液系统进样系统分离系统检测系统数据处理系统15-2高效液相色谱仪液相色谱的基本流程图流动相泵色谱柱检测器输液系统分离系统检测系统数据处理系统AEGBCDF进样阀进样系统由贮液器、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等构成15-2-1高压输液系统(2)高压输液泵：主要部件之一，压力：5～50MPaa.为了获得高柱效而

5、使用粒度很小的固定相（<10μm），要使液体的流动相通过，将施加很大的驱动力b.应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性(1)贮液器：提供流动相，脱气，耐压，溶剂装入前要过滤色谱输液系统内部结构混合腔真空脱气泵(在线脱气)压力传感器蠕动泵清洗瓶一般为50％甲醇，每周更换一次清洗阀比例阀进口单向阀出口单向阀泵往复柱塞泵结构示意图往复柱塞泵结构示意图往复柱塞泵结构示意图往复柱塞泵结构示意图(3)梯度淋洗装置外梯度:将不同极性的溶剂在常温常压下按一定的比例送入梯度混合室，利用一台高压输液泵，泵压进入色谱柱内

6、梯度:将两种或多种不同极性的溶剂分别增压后，按设定的程序，注入混合室混合，再进入色谱柱A:绿原酸B:芦丁工作泵头平衡泵头压力传感器混合腔清洗阀真空脱气泵比例阀废液P680ALPG流路图低压四元梯度泵（只有一个泵，四个通道，溶液泵前混合）需配在线脱气机，因为容易形成气泡15-2-2进样系统-手动及自动进样流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：Load状态Inject状态样品盘机械手自动进样15-2-3分离系统-高效分离柱柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm目前已采

7、用小粒度的填料和柱径以提高柱效应用最广，对大部分有机化合物有响应特点：Ⅰ.灵敏度高、线性范围广；Ⅱ.对流动相的流速和温度变化不敏感；Ⅲ.波长可选，易于操作；Ⅳ.可用于梯度洗脱1.紫外检测器15-2-4检测系统2.光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，检测各特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值,差值与浓度呈正比通用型检测器（每种物质具有不同的折光指数）3.示差折光检测器示差折光检测器光路图安培检测器4.电化

8、学检测器柱后流出物进入反应池，在工作电极表面发生氧化、还原反应，电极间有电流产生，电流大小与流出物浓度成比例，主要用于检测具有电化学活性的物质其它电化学检测器：电导、伏安检测器15-3液相色谱的分类液固色谱液液色谱离子交换色谱排阻色谱化学键合相色谱反相色谱：非极性键合固定相，ODS正相色谱：极性键合固定相，CN基或NH2基键合相15-3-1液-固吸附色谱固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧