流式细胞技术与图像处理

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1、FLOWCYTOMETRY流式细胞技术流式细胞术流式细胞术（FlowCytometry，FCM）是以流式细胞仪为检测手段的一项能快速、精确的对单个细胞(或生物学颗粒)的理化特性进行多参数定量分析和分选的技术。原理：以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其产生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞(微粒)的性状进行定性、定量分析和分选。流式细胞仪简介流式细胞仪（FlowCytometer）是集细胞与分子生物学、流体力学、激光技术、光电子技术、计算机技术、细胞荧光化学技术、单

2、克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。流式细胞仪特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术流式细胞仪的分类分析型流式细胞仪细胞样本分析后最终进入废液桶，不能回收利用。分选型流式细胞仪既能流式分析，还能对分析的目的细胞进行分选；进样管道较长，需要保持无菌状态，所以分选型流式细胞仪一般只用于分选，不兼单纯分析。BD公司产品FACSCalibur特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光细胞分选速度慢，主要用于细胞分析台式机双激光四色，市场覆

3、盖率最高FACSAriaⅢ科研型分选流式细胞仪特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可将感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析FACSVantageDiVa科研型（大型机）特点：多数字化适用用各类细胞分选4路分选BeckmanCoulter流式细胞仪EpicsXL单激光四色，市场覆盖率高，分析型CyAn三激光九色，分析型FC500单激光或双激光五色，市场覆盖率高，分析型Gallios三激光十色，分析型MoFloXDP高端分选型第一节流式细胞仪－结构组成液流系统

4、光学系统电子数据系统细胞分选系统液流系统液流系统鞘流技术：根据层流原理发展起来的技术，可以实现两种液体的同轴流动，样本细胞流位于轴心稳定流动，外面包裹有鞘液(sheath)。流体动力学聚焦：稳定的液流从截面积较大的部分流入截面积较小的部分后，有一个聚焦收缩作用，细胞流直径被约束在10-20um，避免了多个细胞重叠进入检测区。鞘液鞘液细胞流激光照射点流体动力学聚焦示意图液流驱动系统进样速率控制通过改变样本压力可以调节样本的进样速率，而这并不是提高样本流的流速，而是改变了细胞之间的距离。高速时样本流

5、变宽，单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加，这样会导致变异系数增加。光学系统激光特点：单波长、高能量、小发射角、高稳定性光照。光学原理散射信号与荧光信号荧光信号物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光。发射波长(荧光波长)Emissionwavelength激发波长Excitationwavelength＜LongpassShortpassBandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系统：滤

6、光片电子数据系统电子数据系统构成：光电检测器将光信号转换成电子信号。前置放大电路将信号等比例放大，输出电脉冲信号。模数转换器将模拟的电脉冲信号转换成数字信号。数据处理系统计算机系统数据采集、分析。光电检测器(photodetector)光电二极管(photodiode)光灵敏度低，测定强信号（FSC）；光电倍增管(photomultiplier,PMT)光灵敏度高，测定弱信号（SSC,FL1,FL2,FL3,FL4)。PMT前向散射光光电二极管光信号的类型：散射光信号：与标记荧光素无关，是细胞的

7、固有参数。前向散射光(forwardscatter,FSC);侧向散射光(sidescatter,SSC).荧光信号自发荧光：微弱特异荧光：标记的荧光素分子发出的荧光，比自发荧光强很多倍。流式细胞分析的信息——光信号检测流式细胞的基本信息:“形态”散射光的作用实验中，常利用FSC和SSC这两种参数的组合，区分不同的细胞群体，去除碎片、死细胞和粘连细胞的干扰。粒细胞单核细胞淋巴细胞红细胞、死细胞和碎片流式细胞的主要信息:FluorescenceFL1FL2FL3FL4最常用的标记方法是荧光素分子标

8、记的抗体与细胞抗原结合Forwardscatter(FSC)Sidescatter(SSC)FL1-绿色FL2-黄色、橙色FL3-红色FL4-红色488FL1BP530/30515-545nmFITC（绿色，520nm）FL2BP585/42564-606nmPE（黄色，575nm）FL3670LP﹥670nmPE-Cy5、PerCP、PE-Cy7（红色）635FL4BP661/16653-669nmAPC（红色，660nm）流式常见图形(HistogramPlot)适用于：单参数分析DNA倍体