细胞增殖相关基因siRNA干涉文库的构建及其功能研究

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1、摘要摘要目前，利用RNA干涉文库进行大规模、高通量的功能基因扫描已成为发现新功能基因的重要方式和手段。因此我们希望通过构建限制性SiRN』忏涉文库扫描在细胞增殖和分化过程中具有重要作用的新功能基因。通过对原有SiRNA表达载体进行改造，我们构建了新的双启动子siRNA表达载体；根据斯坦福大学2004年公布的在人类胚胎干细胞与造血干细胞增殖、分化过程中具有潜在功能的基因芯片分析结果(http：／／smd．www．stanford．edu／cgi．bin／source／sourceResult．html．1，我们构建了与细胞增殖和分化相关基因siRNA干涉文库。该文库目前包括靶向多个基因的

2、载体，如转录因子、各类蛋白激酶、细胞周期调控蛋白以及一些未知功能基因在内的225个基因。利用这个限制性RNA干涉文库，我们对控制细胞增殖的基因进行筛选。通过WST-1高通量扫描，我们发现了若干同细胞增殖相关的基因：CNKSR3(HomosapiensCNKSRfamilymember3、)和Fosl2(HomosapiensFOS．1ikeantigen2)，扫描结果证实：沉默CNKSR3会促进细胞的增殖，而沉默Fosl2则抑制细胞的增殖功能。在随后的研究中，我们发现过表达CNKSR3．基因会抑制细胞的增殖能力。我们在HeLa、293T、Siha等细胞系中也得到了类似的结果。因此我们推

3、测：CNKSR3在细胞增殖过程中具有重要的生物学功能。关键词：RNA·interferenceRNAilibrarycellproliferationAbsttactHi曲-throughput弱saysbasedontheRNAilibraryhavebeenwidelyusedinscreeningandidemifyingfunctionalgenes．Inthisthesis，weaimtoidentifynewfunctionalgeneswhichcallcontrolproliferationanddifferentiationofcellsllsiI坞establish

4、edsmallinterferingRNAlibrary．Torealizethis，1)WeconstructanewplasmidwhichcouldexpresssiRNAbymodifyingcommercialvectors；2)Webuiltaplasmid—basedsiRNAlibrarywhichcontainedthegenesthatchangedupordownover2foldsaccordingtothemicroarrayassayoftheStanforduniversity(http：／／smd·WWVq．stanford．edu／cgi-bin／so

5、urce／sourceResult．html)．Thelibrarycontains450vectorstargetingdifferentkindsof225humangenes，includingtranscriptionfactors，proteinkinases，andfunction·ullkllowngenes．3)Usingthislibrary，wefoundthatCNKSR3(HomosapiensCNKSRfamilymember3)andFos／2(HomosapiensFOS-likeantigen2)playanimportantroleincontroll

6、ingproliferationanddifferentiationofcells．Indeed，silencinggeneCNKSR3(HomosapiensCNKSRfamilymember3)couldpromotetheproliferationofHeLacells；whereassilencinganothergeneFos／2(HomosapiensFOS-likeantigen2)decreasethecellproliferation．Overexpressionofthesegenesalsoshowedtheirregulationonthecellprolife

7、rationandCanreducethecapabilityofcellproliferation．Theseresultshavebeenfurtherconfirmedinotherdifferentkindsofcelllines，293T，SK—OV·3andSihacelllines．Thus，CNKSR3maybeoneofthemostimportantadaptor-moleculesintheprocessofcellpro