几种植物病原原核生物实时荧光PCR检测方法的研究

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1、几种植物病原原核生物实时荧光PCR检测方法研究摘要细菌、植原体是两类重要的植物病原原核微生物,能导致许多农作物及林木花卉严重减产、绝收甚至物种大范围死亡。它们当中许多种在我国已有发生,也有相当一部分在我国没有分布,对我国农业及生态环境构成极大威胁,已列为或需要列为检疫的有害生物。传统的细菌分类、检测和鉴定,主要依靠人工培养、寄主范围等理化生物学特征,不准确,难以标准化,更有甚者往往造成分类上的不稳定和混乱。而植原体和一部分细菌不能培养,以致长期以来无法进行有效的分类和检测鉴定。近年来国内外利用16SrDNA等保守

2、基因进行分子进化研究,为这两类病原检测鉴定提供了重要理论依据。尤以实时荧光PCR是国际上近年发展起来的新技术,即在普通PCR方法的基础上,加入了一条荧光标记的探针,利用荧光信号积累,实时监控整个PCR过程,提高了检测的准确度、灵敏度和检测速度,被认为是植物病原鉴定和病害诊断的革命性方法。仅历时10年该方法已广泛应用人类病原菌检测。1999年Bohm首次将实时定量PCR方法应用于对植物病原真菌的检测。该方法在植原体上的应用,迄今国内外还未见报道,而用于植物病原细菌的检测鉴定,仅国外有5篇报道,国内未见报道。本研究中

3、,选择了植原体、柑桔黄龙病病菌、水稻自叶桔病菌与水稻细菌性条斑病菌作为研究对象,其共同特点为:均为检疫性有害生物;不能培养菌、难培养菌和可分离培养的菌,涵盖了原核生物的所有类群i为实际工作中检测鉴定的难题。本研究采用第三代分子标记即根据基因点突变和单核苷酸多态性(SNP)的差异设计TaqMan探针。初步建立了植原体、细菌实时荧光PCR检测鉴定方法体系框架。并利用样品进行了实际检测,证明是一种简单、快速、灵敏、准确检测鉴定原核生物的新方法。为其他植物病原微生物检测鉴定研究提供了新思路,为农业和植物检疫部门提供了可靠

4、的技术支持和科学保障。主要研究结果如下:1.提出了比较系统和完整的原核生物分子鉴定分类的筛选体系。其技术路线为:在前人工作的基础上,根据GeneBank中所有植原体或细菌的16SrDNA等保守区设计植原体和细菌通用引物和广谱探针,由此可将待检测样品区分为植原体或细菌两大类;同理,在通用引物对扩增片断区间,找出植原体组内保守而组间基因序列具稳定性点突变区,细菌找出属内或种内保守而属内,种内或变种间序列具稳定性点突变区,分别设计植原体小组I(种)或细菌属、种和变种的特异性探针。2.在国际国内首次根据16SrDNA自行

5、设计合成了实时荧光PCR检测的TaqMan高效检测探针6个,其中植原体广谱探针1个,组特异性探针4个,细菌广谱性探针1个,柑桔黄龙病菌特异性探针1个。其探针序列均己申请专利保护。3.水稻白叶枯菌和水稻细菌性条斑病菌为高度近似种,其16SrDNA,16S.23SrRNA间区,ISIll3扦入序列等常用靶基因,两菌完全相同。在世界上首次选用含铁细胞接受子基因作为植物病原细菌分子诊断中的靶基因,设计合成了1个水稻白叶枯菌特异性探针,1个水稻细菌性条斑病菌特异性探针,用于实时荧光PCR检测和鉴别区分该两种病原菌。其探针序

6、列均己申请专利保护。4.在国内首次成功克隆并测定了中国柑桔黄龙病病原16SrDNA基因序列,经同源性比较,表明属于柑桔黄龙亚洲种中一个新株系。其测序的16SrDNA序列片段已被Genebank收录,其登录号为AYl92576。5.在国内首次成功克隆并测定了中国泡桐丛枝病原16SrDNA基因序列,经同源性比较,表明属于植原体16SrI.D中的一个新株系。其测序的16SrDNA序列片段已被Genebank收录,其登录号为AYl92577。6.梨衰退病是我国一种重要的世界性对外检疫性病害,该病在我国还没有报道。本试验在

7、国内首次引进了梨衰退病植原体总核酸,并在国内首次克隆并测定了其16SrDNA基因序列,经同源性比较,与GeneBank中梨衰退病植原体序列同源性达99.72%。7.分别建立了植原体分类鉴定和检测、柑桔黄龙病病原检测、水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌检测鉴定区分的实时荧光PCR方法。国内外未见同类报道。试验结果表明,所有探针均只能特异性检测到且标病原菌;整个检测过程只需2小时;灵敏度比普通PCR电泳检测高100倍;其检测的绝对灵敏度为30.33龟质粒DNA,相当于1个细菌细胞的基因,相对灵敏度为105CFU/m1

8、个细菌细胞。操作简单,整个检测过程实行自动化控制,完全闭管,消除了PCR假阳性的污染,无须PCR后处理。8.对所建立的植原体实时荧光PCR反应体系和反应条件进行筛选优化,获得最佳反应体系。为开发研制成实时荧光PCR试剂盒及检测方法标准化奠定了基础。9.建立了植物组织中提取病原菌模板DNA的方法.CTAB微量快速抽提法,此法只需要0.2.0.39植物样品,带菌种子的浸泡液O

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1、几种植物病原原核生物实时荧光PCR检测方法研究摘要细菌、植原体是两类重要的植物病原原核微生物,能导致许多农作物及林木花卉严重减产、绝收甚至物种大范围死亡。它们当中许多种在我国已有发生,也有相当一部分在我国没有分布,对我国农业及生态环境构成极大威胁,已列为或需要列为检疫的有害生物。传统的细菌分类、检测和鉴定,主要依靠人工培养、寄主范围等理化生物学特征,不准确,难以标准化,更有甚者往往造成分类上的不稳定和混乱。而植原体和一部分细菌不能培养,以致长期以来无法进行有效的分类和检测鉴定。近年来国内外利用16SrDNA等保守

2、基因进行分子进化研究,为这两类病原检测鉴定提供了重要理论依据。尤以实时荧光PCR是国际上近年发展起来的新技术,即在普通PCR方法的基础上,加入了一条荧光标记的探针,利用荧光信号积累,实时监控整个PCR过程,提高了检测的准确度、灵敏度和检测速度,被认为是植物病原鉴定和病害诊断的革命性方法。仅历时10年该方法已广泛应用人类病原菌检测。1999年Bohm首次将实时定量PCR方法应用于对植物病原真菌的检测。该方法在植原体上的应用,迄今国内外还未见报道,而用于植物病原细菌的检测鉴定,仅国外有5篇报道,国内未见报道。本研究中

3、,选择了植原体、柑桔黄龙病病菌、水稻自叶桔病菌与水稻细菌性条斑病菌作为研究对象,其共同特点为:均为检疫性有害生物;不能培养菌、难培养菌和可分离培养的菌,涵盖了原核生物的所有类群i为实际工作中检测鉴定的难题。本研究采用第三代分子标记即根据基因点突变和单核苷酸多态性(SNP)的差异设计TaqMan探针。初步建立了植原体、细菌实时荧光PCR检测鉴定方法体系框架。并利用样品进行了实际检测,证明是一种简单、快速、灵敏、准确检测鉴定原核生物的新方法。为其他植物病原微生物检测鉴定研究提供了新思路,为农业和植物检疫部门提供了可靠

4、的技术支持和科学保障。主要研究结果如下:1.提出了比较系统和完整的原核生物分子鉴定分类的筛选体系。其技术路线为:在前人工作的基础上,根据GeneBank中所有植原体或细菌的16SrDNA等保守区设计植原体和细菌通用引物和广谱探针,由此可将待检测样品区分为植原体或细菌两大类;同理,在通用引物对扩增片断区间,找出植原体组内保守而组间基因序列具稳定性点突变区,细菌找出属内或种内保守而属内,种内或变种间序列具稳定性点突变区,分别设计植原体小组I(种)或细菌属、种和变种的特异性探针。2.在国际国内首次根据16SrDNA自行

5、设计合成了实时荧光PCR检测的TaqMan高效检测探针6个,其中植原体广谱探针1个,组特异性探针4个,细菌广谱性探针1个,柑桔黄龙病菌特异性探针1个。其探针序列均己申请专利保护。3.水稻白叶枯菌和水稻细菌性条斑病菌为高度近似种,其16SrDNA,16S.23SrRNA间区,ISIll3扦入序列等常用靶基因,两菌完全相同。在世界上首次选用含铁细胞接受子基因作为植物病原细菌分子诊断中的靶基因,设计合成了1个水稻白叶枯菌特异性探针,1个水稻细菌性条斑病菌特异性探针,用于实时荧光PCR检测和鉴别区分该两种病原菌。其探针序

6、列均己申请专利保护。4.在国内首次成功克隆并测定了中国柑桔黄龙病病原16SrDNA基因序列,经同源性比较,表明属于柑桔黄龙亚洲种中一个新株系。其测序的16SrDNA序列片段已被Genebank收录,其登录号为AYl92576。5.在国内首次成功克隆并测定了中国泡桐丛枝病原16SrDNA基因序列,经同源性比较,表明属于植原体16SrI.D中的一个新株系。其测序的16SrDNA序列片段已被Genebank收录,其登录号为AYl92577。6.梨衰退病是我国一种重要的世界性对外检疫性病害,该病在我国还没有报道。本试验在

7、国内首次引进了梨衰退病植原体总核酸,并在国内首次克隆并测定了其16SrDNA基因序列,经同源性比较,与GeneBank中梨衰退病植原体序列同源性达99.72%。7.分别建立了植原体分类鉴定和检测、柑桔黄龙病病原检测、水稻白叶枯病菌与水稻细菌性条斑病菌检测鉴定区分的实时荧光PCR方法。国内外未见同类报道。试验结果表明,所有探针均只能特异性检测到且标病原菌;整个检测过程只需2小时;灵敏度比普通PCR电泳检测高100倍;其检测的绝对灵敏度为30.33龟质粒DNA,相当于1个细菌细胞的基因,相对灵敏度为105CFU/m1

8、个细菌细胞。操作简单,整个检测过程实行自动化控制,完全闭管,消除了PCR假阳性的污染,无须PCR后处理。8.对所建立的植原体实时荧光PCR反应体系和反应条件进行筛选优化,获得最佳反应体系。为开发研制成实时荧光PCR试剂盒及检测方法标准化奠定了基础。9.建立了植物组织中提取病原菌模板DNA的方法.CTAB微量快速抽提法,此法只需要0.2.0.39植物样品,带菌种子的浸泡液O

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