miR141在膀胱尿路上皮癌中的表达及其功能研究

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1、中图分类号UDCR6946l0博士学位论文学校代码!Q53三密级．公珏miR-141在膀胱尿路上皮癌中的表达及其功能研究ThestudyofexpressionandfunctionofmiR—·141inbladderurothelialcarcinoma作者姓名：王军学科专业：临床医学研究方向：外科学学院(系所)：湘雅医院指导教师：齐琳教授论文答辩日期答辩委员会主席中南大学二零一三年五月一令一二，平丑月锄元’原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他

2、人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中南大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同工作的同志对本研究所作的贡献均已在论文中作了明确的说明。作者签名：丕车日期：弛止年』月丑日学位论文版权使用授权书本人了解中南大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并根据国家或湖南省有关部门规定送交学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文。同时授权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到《中国学位论文全文数据库》，并通过网络向社会公众提供信息服务。日期：2巫年竺月五日摘要第

3、一部分miR．141在膀胱尿路上皮癌组织及膀胱癌细胞株中的表达目的研究膀胱尿路上皮癌组织及相关细胞株miR．141及EMT相关蛋白的表达情况。方法采用实时荧光定量PCR检测20例膀胱尿路上皮癌及不同膀胱尿路上皮癌细胞株miR一141的表达水平，分析其与膀胱尿路上皮癌临床参数的关系；采用Werstern。blot技术检测膀胱尿路上皮癌组织、淋巴结转移灶及相关细胞株EMT相关蛋白的表达情况，评估其EMT状态，并分析不同EMT状态组织及细胞株miR．141的表达情况。结果同正常尿路上皮粘膜及癌旁组织相比，miR．141在尿路上皮癌组织中的表达显著上调；同表浅性膀胱癌

4、相比，miR．141在肌层浸润性膀胱癌中的表达则显著下调；同EMT程度较轻肿的瘤原发灶相比，miR．141在EMT程度较强的淋巴结转移灶中的表达显著下调；相对于EMT程度较轻的HTB9及T24细胞株，miR．141在EMT程度较强的UMUC3细胞株中表达水平显著下调。结论随肿瘤分期及分级的提高，miR一141表达水平逐渐降低；无论是膀胱尿路上皮癌组织还是细胞株，随EMT程度的增加，miR一141的表达水平均逐渐降低；在尿路上皮癌进展过程中，miR．141及EMT相关蛋白可能都具有重要作用。博士学位论文关键词膀胱尿路上皮癌；hsa．miR．141；上皮间质转化第

5、二部分pri．mir．141慢病毒载体的构建及稳定转染膀胱癌UMUC3细胞株目的构建miR一141过表达膀胱癌细胞株，为进一步的体外细胞研究提供基础。方法将根据miRBase数据库数据合成的pri．mir-141序列克隆至pLVX．IRES．ZsGreenl构建pYr—LVX．pri—mirl41表达质粒，并行质粒酶切鉴定及测序；将构建的miR．141过表达质粒pYr．LVX．pri．mirl41及空白对照质粒pLVX．IRES．ZsGreenl分别进行慢病毒包装并测定慢病毒滴度；不同的慢病毒颗粒侵染靶细胞UMUC3，构建miR一141过表达细胞株UMUC3—

6、141及空白对照细胞株UMUC3一neg，检测UMUC3、UMUC3．neg及UMUC3—141中miR．141的表达水平。结果酶切鉴定及测序结果显示pYr-LVX．pri．mirl41表达质粒构建成功；荧光检测及滴度测定显示293T细胞慢病毒包装成功；实时荧光定量PCR检测结果显示，同UMUC3及UMUC3．neg细胞相比，UMUC3．141细胞株miR一141表达水平显著提高。结论酶切鉴定及碱基测序比对结果表明miR一141过表达载体pYr．LVX．pri．mirl41构建成功；膀胱癌miR．141过表达细胞株UMUC3．141及对照细胞株UMUC3．ne

7、g建立。关键词质粒；慢病毒；转染II博士学位论文第三部分过表达miR．141对膀胱癌UMUC3细胞株生物学行为的影响目的检测过表达miR．141对膀胱癌UMUC3细胞株生物学行为的影响。方法分别采用细胞划痕修复实验、transwell侵袭小室实验、MTT检测、平板克隆形成实验及流式细胞凋亡检测技术检测膀胱癌UMUC3、UMUC3．neg及UMUC3—141细胞的转移、侵袭、增殖、克隆形成及抗凋亡能力。结果细胞划痕修复实验显示：48小时后，UMUC3．141细胞的划痕迁移率较UMUC3及MUC3．neg细胞显著降低；Transwell小室实验显示：36小时后，U

8、MUC3．141细胞的细胞穿透数较UM