氟致大鼠肝、肾细胞损伤机制及抗氧化营养素的干预性研究

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1、中国医科大学博士学位论文氟致大鼠肝、肾细胞损伤机制及抗氧化营养素的干预性研究姓名：贾丽红申请学位级别：博士专业：细胞生物学指导教师：孙贵范2002.4.1中文摘簧麓蛮氟中毒是严重危害人体健康的主要地方病之一。我国是地方性氟中毒的重度流行国家，目前受累人数达1亿多。有关氟中毒的病理机制尚不十分清楚，对氟中毒病人也缺芝有效的治疗药物。爵妩有关氟中毒病理梳镧的研究以及拮抗过誊氟对枫体损伤辩素的研究就显褥卡分必要。憨方性氟中毒是由子人织长期生活在褰氟环境或生滔习惯摄入过鬟氟{i霾弓{起的慢性篱积性中毒，以牙齿、骨骼等硬组织损伤最为明显。近年来，随着对氟中毒的深入研究，地方性氟中毒的非骨相损害越来

2、越引起国内外学者的关注。地方性氟中毒(地氟病)的病理机制十分复杂，舀前尚无一致的解释。最近有学者指出邈氟病静发病橇裁主要有驻下黧方衙学说：1)低营养低钙学瀵，2)盘壶基学说，3)镁学说。近年来，随著囊虫基学说理论的研究深入，在谈到氟中毒的非臀祖损害时，人们常认为与自由基、氧化应激有关。大量动物实验的结皋也提出氟可致大鼠或小鼠脂质过氧化作用增强，机体MDA禽量增高，抗氧化酶(SOD，GSH—Px，CAT)活性降低；并盈补究井源羧挽裁纯营养素《se，Vc，VE，GSH，器一Carotene)可以不嗣程度的接摭或降低氟孽l起的过氧化发应。但瞧有一些研究结果与之相反。如氟臂瘟患者全血Cu，Zn-

3、SOD活性明显离子正常对照组；小鼠短期摄入较低剂量氟可增强抗氧化作用。在国外，Saralakumari等检测印度慢性氟中毒患者，发现其血审C,SH含量明显增加，并伴有红细胞GS聪一px等活力升高，认为这是氪细胞对抗氯纯应漱鹃一种方式。这些互为矛盾豹结举是交予实验条件《染毒热量、时阕、缎织种类)奄检测手段懿不网，还是反映氟化物本身作用机制的多榉性，现在还难以定论。氟化物是否具有潜在致癌性仍然是目前氟健康效应研究的课题。许多研究证实氟可导致体外培养的哺乳细臆，包括人体纲耱产生遗传物质损伤，微核及染色棒畸变。健也有楣反静结论。F对遗传物质援伤懿撬制淹苓溥楚。以往研究主要采用氟中毒大鼠或氟中毒患

4、者，研究氟对机体氧化与抗氧化平衡的影响，同时给予单一或二种抗氧化剂，观察是否有拮抗氟的毒性作用。众所周知，机体在许多情况下如饥饿、劳累、乏氧、创伤、吸烟以及营养状况等均可影响氧化与抗氧化平衡，导致氧化应激作用增强，而氧化应激又可引起机体多组织多器官的损伤。Vc、VE、se和GSH都是体内重要的抗氧化营养素，但他们在发挥抗氧化机制方面有所不同。因此，本实验以氟中毒非骨相损伤容易受累的组织肝细胞和肾细胞为研究靶子，首先通过细胞增殖反应，直接研究氟对肝、肾细胞造成的毒性作用，以确定氟的毒作用剂量；在此基础上，研究此毒作用剂量下的氟对肝、肾细胞氧化与抗氧化平衡的影响及对DNA的损伤作用，同时探讨

5、不同抗氧化营养素对上述氟造成的细胞损伤是否有拮抗作用。为进一步探讨氟中毒的发病机制，预防和治疗氟中毒的发生与发展提供科学依据。材料与方法材料：NaF，Na_2Se03，DL—a一生育酚(a—Tocopherol，E．Merck)，二甲基亚砜，还原型GSH(日本产品)，Vc(东北制药总厂生产)，RPMI1640培养液(sigma，含10％胎牛血清，100U／mL青霉素，100肛g／mL链霉素)，胰蛋白酶(Difco)，考马斯亮蓝G250，黄嘌呤，黄瞟呤氧化酶，AlamarBlue，低熔点琼脂糖(华美公司)，正常熔点琼脂糖，TritonX一100(Sigma)，瞄8(进口分装)，水平电泳槽和

6、电泳仪(北京六一仪器厂)，OlympusBX60荧光显微镜(日本)，NikonFX一35A数码相机(日本)。方法：采用组织块酶消化法，分离培养大鼠肝、肾细胞。选择生长繁殖良好的细胞并分组如下。NaF组：加入不同浓度的NaF培养48h。抗氧化营养袭组：预先在肝、肾细胞培养液中加入一定剂量的Vc、v卧Se和GSH作用12h后，再加入不同浓度NaF共同培养36h。首先通过细胞增殖反应，确定造成肝、肾细胞损伤的毒作用剂量；然后在此基础上研究氟对细胞氧化与抗氧化能力的影响及对DNA的损伤作用，同时探讨不同抗氧化营养素对氟的干预作用。指标测定：·2·l肝、肾细胞增殖率用AlamarBlue“还原率表

7、示。2蛋白质测定采用考马斯亮蓝法。3MDA的测定：硫代巴比妥酸(TBA)法，单位以nmoL／ml表示。4SOD活性的测定：亚硝酸盐法，以亚硝酸盐单位／每mg蛋白含量(NU／mg．pr)表示酶活性。5GSH—Px活性测定：改良DTNB法，以U／mg．pr表示酶活性。6细胞DNA损伤：采用单细胞凝胶电泳实验。结果(一)NaF对大鼠肝、肾细胞增殖反应的影响及抗氧化营养素的干预作用1．当NaF的浓度分别为0．5mmol／L和0．Immol／