外源基因GAFP提高水稻纹枯病抗性的效应研究

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1、StudyonResistancetoSheathBlightforTransgenicGAFPRiceLinesByPengL正iADissertationSubmittedtoYangzhouUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementfortheMasterDegreeofAgriculturalScienceSupervisorByProf．PanXuebiaoYangzhouUniversityYangzhou，225009，P．R．ChinaMay2013

2、摘要水稻原产亚热带，是中国乃至世界的重要粮食作物之一，也是我国一半以上人口的主粮。而纹枯病是水稻的三大病害之一，俗称烂脚病，花脚杆。随着植株矮化，栽培密度和施肥水平的提高，纹枯病的危害日益加重。根据调查显示，纹枯病已经成为了中国南方部分水稻种植区的第一大病害，严重威胁着水稻的产量。本研究从天麻中分离得到天麻抗真菌蛋白(简称GAFP)及其3个同源序列，并通过添加信号肽进行载体优化，共构建了8个植物转化载体。通过农杆菌介导法导入到徐稻3号和R6547中，并通过组培手段得到转化苗，然后进行分子检测和田间鉴定，确定其是否能

3、提高水稻对纹枯病的抗性。主要的研究结果有：1．组织培养体系的优化(1)徐稻3号的培养基的选择：徐稻3号在N6诱导培养基上的愈伤组织结构致密、颜色为嫩黄色、呈颗粒状、表面光滑、生长旺盛。而在MS诱导培养基上的愈伤组织颜色为暗黄色、呈不分散的表面水渍状，不利于继代培养。所以选择N6培养基。(2)添力NABA对水稻成熟胚愈伤组织的影响：与不添jJHABA相比，添=cIHABA可有效的抑制胚芽生长，并有利于胚性愈伤的形成，获得的愈伤组织结构致密，质地坚硬，表面有突起，呈乳白色，并稍提高其成熟胚愈伤组织的诱导率。(3)水稻愈

4、伤组织对筛选剂G418的敏感测验：，R6547的愈伤组织比徐稻3号的愈伤组织对G418更敏感。徐稻3号的愈伤组织在添加350mg／L的G418时对本身产生伤害，但是添加50—150mg／L时，对愈伤组织没有选择的作用，所以在250mg／L的G418时，是选择抗性愈伤组织的最适浓度，所以本试验徐稻3号的G418一筛浓度为150mg／L，二筛浓度为250mg／L；同理R6547的G418一筛浓度为100mg／L，二筛浓度为150mg／L。2．转基因水稻植株的分子检测通过PCR检测阳性转化子和阳性纯系；然后进行South

5、ern杂交证实基因已经整合到受体基因组中及其拷贝数；实时定量PCR检测其相对表达量。3．转基因后代对纹枯病的抗性表现徐稻3号和R6547有7个载体的转化后代进入T2代抗性鉴定试验，这7个载体分别为G1、G2、SG2、G3、SG3、G4、SG4，共计116个纯合转化株系参试。研究发现，与对照相比，GAFP的转化后代病级极显著地减轻，其中SG2的抗性效果做好，病级减轻了1．16。徐稻3号2个载体SGl、G2和R65471个载体SGl，由于得苗较迟，采用Tl代植株进行抗性接种鉴定。每个载体有3个转化子。每个载体的转化子检

6、测阳性株和阴性株，并与各植株的病级相对应，进行统计分析。结果表明，各载体下阳性株和阴性株的平均病级之间存在极显著差异，说明这些载体的转化后代(阳性株)比阴性株的病级极显著地减轻。关键词：水稻，纹枯病，GAFP，组织培养，抗性鉴定AbstractRiceisnativetosubtropicalzone，whichisoneofthemostimportantfoodcropsintheworld．ItaccountsforabouthalfpercentofcerealconsumptioninChina．Shea

7、thblightisoneofthethreemostseriousricediseasesworldwide．Astheplantdwarfing，increasingplantdensityandfertilizerlevel，thediseaseaggravatedprogressively．Theresearchonresistancetosheathblightdiseasedevelopsrapidlyandhasbecomethemostseverediseaseinpartofsouthernric

8、e-growingregionofourCOuntry．Anantifungalproteinofgastrodiaclara(GAFP)geneandthe3homologoussequenceshavebeenclonedandaddedaguidepeptide，constructed8plantexpressionvectors．Theyweretr