弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究

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1、浙江大学博士学位论文弹性蛋白酶发酵工艺及其发酵动力学研究姓名：陈启和申请学位级别：博士专业：食品科学指导教师：何国庆2003.5.1浙江大学博士学位论文(3)采用部分因子设计和中心组合设计对培养条件进行了筛选和优化，影响细胞生长和弹性蛋白酶产生的主要因子是培养时间和摇床转速，两个因子对弹性蛋白酶合成和细胞生氏的影响是不一致的，并获得了摇瓶发酵下较优的发酵条件为：220r／min，25h，此时模型预测的最大响应值为434U／ml。探讨不同培养温度下细胞生长、底物消耗和产物合成发现，37。C下培养更有利于弹性蛋白酶合成，35℃

2、下细胞的比生长速率要明显高于37℃添加弹性蛋白能明显提高生物量的积累，但对产物合成提高不明显。同时对不同添加时间进行了研究．发现所试验的两种时间下，弹性蛋白对弹性蛋白酶合成和细胞生艮的调控效果是完全不同。细胞生长过程中存在比较明显的波动现象。首先分析了玉米提取物对生K的影响，玉米提取物是细胞生长和弹性蛋白酶合成的必需因子，无论添加与否，菌体生长过程中都山现了比较明显的波动：摇瓶发酵和罐发酵的数据相结合探讨了菌体生长波动现象的原因。实验结果显示无论是采用摇瓶还是5-L罐作为发酵体系，细胞生长波动的本质并没有改变。SDS—PA

3、GE分析了不同发酵条件和发酵方法下胞外蛋白质的变化，从I乜泳的蛋白质条带数量上似乎并不能很好解释细胞生跃波动的原因。(4)研究了芽孢杆菌EL314CFIO的分批发酵工艺和发酵动力学，芽孢杆菌EL314CFIO生产弹性蛋白酶的发酵类型可能属于生长部分关联型。4％的葡萄糖浓度更有利于底物代谢，菌体生长速度要快，但最大生物量和弹性蛋白酶分泌水平没有7．4％的高，因此可以考虑在发酵过程中采取流加碳源来解除过高葡萄糖浓度对生k比速率抑制。一定范围内提高搅拌转速il；Ol快底物的转化和菌体的生成，有利于弹性蛋白酶的分泌．尤其是前期的通

4、气鼙对发酵影响尤为显著。发酵中的溶解氧是指导发酵过程的一个非常重要参数，可以将它作为发酵放大的依据。用Logistic方程、Leudeking-Piret方程和Leudeking-Piret-Like方程分别描述细胞生长、产物合成和弹性蛋白酶合成的动力学规律，动力学模型如下：面20．44(1一号沁dP：38150dx一48x一查：3．01生+0．06xX浙江大学博=L学位论文对三个动力学模型参数的检验结果也可以显示，所建立的菌体生长和底物消耗的动力学模型可以很好地解释实际发酵中细胞生长、底物代谢的过程。在转速400r／mi

5、n，2L／min通气量下发酵30小时弹性蛋白酶分泌水平达到近350U／ml。(5)不同的补料方式对细胞比生长速率和弹性蛋白酶比合成速率和底物的利川比速率有着显著的影响。四种补料方式的研究结果可以证实，补料方式3能明显提高弹性蛋白酶的分泌，即在流加过程中尽可能降低补料液的浓度，降低初始培养基的量，这样可以提高流加的效果。溶氧是前期细胞生K过程最为重要的因子，如果在发酵前期补糖过多或初始糖源过多或补料方式不适宜都会造成生艮前期氧气供应不足，从而造成菌体生长的缓慢；不同浓度氮源和氮源流加对发酵过程影响的数据可以看出，一定范围内提

6、高氮源浓度是可以促进弹性蛋白酶的分泌和菌体的积累，但过高浓度的氮源或流加时间不合适都会造成较低的细胞生长量和弹性蛋白酶分泌水平。(6)探讨了粗料作为替代原料在弹性蛋白酶生产中应用的可能，结果显示，麸皮和豆饼粉分别是所实验的粗料中晟好的碳、氮源。同时还发现豆饼粉经碱水解后能极大促进弹性蛋白酶的分泌；响应面优化方法优化得到一较佳的粗料发酵培养基组合(g／lOOmL)：3．42％麸皮、9．4％豆饼粉碱解液(ml／lOOmL)、0．1％玉米提取物、0，2％K2HP04、0．02％MgS04·2H20：优化后培养基的摇瓶发酵及5．L

7、罐的发酵过程研究揭示，采用优化后的培养基进行发酵研究明显能提高弹性蛋白酶的分泌。(7)表面活性剂和氧载体对芽孢杆菌EL314CFl0生蚝和产物合成过程的影响进行了探讨，发现在所试验的氧载体中，只有4％Tween_80能极大地提高细胞的生氏、弹性蛋白酶的合成。Tween．80添加策略的优化研究结果显示，4．6％的添加浓度和初始pH7．68时弹性蛋白酶合成水平最高。建立了罐中Tween-80不同的添加方式对细胞生长、产物合成和底物消耗的动力学模型，拟合结果显示，两种添加方式下以菌体生K雨I底物消耗的拟合度最好。拟合动力学参数检

8、验结果显示．两种流加方式对细胞比生氏速率没有显著改变，唯一的差别是0小时添加更有利于‘弹性蛋向酶合成。初步分析了Tween．80在促进弹性蛋白酶合成和细胞生长过程中的作用，实验表明，Tween一80在发酵过程中并没有显著地改善溶氧的传递。同时Tween-80在添加过程中可以起部分碳源的作用，扫描电镜和S