妇科恶性肿瘤造血干细胞GSTπ基因治疗的基础研究

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1、重庆医科大学硕士学位论文妇科恶性肿瘤造血干细胞-GSTπ基因治疗的基础研究姓名：罗晓英申请学位级别：硕士专业：妇科肿瘤指导教师：唐良萏2003.5.1重庆医科大学硕士学住论文英文缩写英文全称AMPADMBpCFUCDDPCTXDNADMSOGST尢G418HSCLBLAM订NCSPBSrpmTETEM符号说明AmpicillinadriamycinbasepairColonyformingunitCisplatincyclophosphamidedeoxynucleicaciddimethylsulfoxideeGI

2、utathionetransfcrase兀NeomycinhaemopoieticstemcellLuria-BertaincultureLBmediacontainingampieillin3·r4、5-dimethyllthiazol·2-y1)-2、5-diphenyltetrazoliunbromideNewcalfserumPhosphate-bufferedsalineroundsperminuteTris-HClandEDTAbuffertransmissionelectronmicroscope1中文

3、名称氨苄青霉素阿霉素碱基对克隆形成单位顺铂环磷酰胺脱氧核糖核酸二甲基亚砜谷胱甘肽转移酶兀新霉素造血干细胞LB培养基含氨苄青霉素的LB培养基四甲基偶氮唑盐新生牛血清磷酸盐缓冲液每分钟转数Tris盐酸乙二氨四乙酿缓冲液透射电镜术重庆医科大学硕士学位论文s妇科恶性肿瘤造血干细胞．GST丌基因治疗的基础研究研究生导师摘要罗晓英唐良萏副教授目的：卵巢恶性肿瘤是妇科恶性肿瘤患者死亡的主要原因，多数卵巢恶性肿瘤患者就诊时已是晚期，对卵巢恶性肿瘤患者的治疗主要是手术和化学治疗。患者的预后很大程度上取决于对化疗的敏感性，但大部分癌细胞

4、都会产生耐药，最终导致化疗失败，患者预后不良。对化疗耐药的研究发现卵巢恶性肿瘤耐药与多药耐药基因如GSTn在卵巢恶性肿瘤中的高表达有关，为了克服化疗耐药，临床上需要加大抗癌药物的剂量，但超大弃Ⅱ量化疗(}fDC)往往又会造成对骨髓的严重抑制。为了抵抗化疗药物对骨髓的抑制作用．本课题拟把耐药基因GSTⅡ导入造血干细胞(HSC)，增强造血系统对化疗的耐受性郴研究的目的是构建重组质粒pLXSN-GSTⅡ和建立一株稳定的产病毒包装细胞PA317／GST丌，利用该包装细胞产生的逆转录病毒感染K562，研究GST订与CDDP、A

5、DM和CTX耐药的关系，检测含有GST丌基因的逆转录病毒感染K562的感染率，为GSTⅡ进一步以提高造血系统对CDDP和ADM等抗癌药物的抵抗的研究奠定制性内切酶HpaI、Bamh1分别双酶切质粒pLXSH—GSTⅡ和小片段和pLXSN大片段．在T4连接酶的作用下。构建重组质粒pLXSN—GSTn；酶切鉴定重组质粒pLXSN-GSTⅡ后，用脂质体和电穿孔两种转染方法转染PA317包装细胞，G418筛选获得抗性克隆，用宫颈癌细胞株Hela测定抗性克隆产生的病毒的滴度。在37℃条件下培养筛选出的最高病毒滴度的细胞株PA3

6、17／HGSTn／B3-6，收集病毒上清，用过滤冻存后的病毒上清感染K562白血病细胞，SP法检测感染后的K562细胞中GSTⅡ蛋白的表达，MTT法测定转染后的K562对CDDP、ADM和CTX的敏感度。结果：1．酶切重组质粒pLXSN—GST·本课题获重庆市科委科研基金资助(2000—178)2重庆医科大学顾士学位论文n，凝胶电泳酶切产物见目的片段DNA；2．利用脂质体和电穿孔两种转染方法将重组逆转录病毒载体pLXSN—GSTT[导入包装细胞PA317中，建立了双向性产病毒细胞株PA317／GSTn／B3—6，其产

7、生的病毒滴度为2．2×103，该逆转录病毒含有人全长GSTncDNA。3．用逆转录病毒介导，通过病毒上清液连续4次感染，成功地将外源性耐药基因GSTn转入K562的细胞中，用SP免疫组化法测得逆转录病毒的感染率为29％。4．MTT测得感染后的K562细胞具有多药耐药功能，GSTⅡ可感入K562白血病细胞，该成功预示着运用逆转录病毒转染体系把GSTⅡ导入造血干细胞是一种可行的基因治疗方法。本课题为临床应用GSTⅡ基因转染造血干细胞，回输入患者体内，保护造血系统免遭化疗损害，从而为实施大剂量、冲击式化疗，提高卵巢恶性肿瘤

8、根治率、降低卵巢恶性肿瘤复发率、延长患者的生存期以及提高患者5年生存率奠定了坚实的基础，对将来临床应用GSTⅡ基因治疗以提高包括卵巢癌在内的恶性肿瘤的治疗效果具有重要意义，对患者的有效治疗将具有重要的社会价值。[关键词]耐药基因GST1【逆转录病毒包装细胞海热K562卵巢恶性肿瘤3重庆医科大学硕士学位论文TheBaseResearchofGen