耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究

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1、浙江大学博士学位论文耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究姓名：孙建义申请学位级别：博士专业：特种经济动物与饲养指导教师：许梓荣20030501耐热末聚耱酶杂台基因的构建、表达噩产物的酶学特性研究博士学位论文在pH5．0～7．0之间酶活性较高，pH4．0～7．0之间较为稳定；Tfx的最适反应pH为6．0，在pH5．0～7．0之间酶活性较高，pH5．0～9．0之间较为稳定。通过对木聚糖酶BSX和Tfx的成熟肽氨基酸序列同源性和二级结构单元的分析，设计并构建了耐热杂合木聚糖酶分子，通过表达获得了耐热杂合木聚糖酶基因工程菌EcoliHX，分

2、离和纯化了表达产物，进而系统研究了其酶学特性。以pGEM*．TEasyBSXVector为模板，5RBsX02、3RBsX01(含限制性内切酶XhoI)为引物扩增出532bp基因片断；以pGEM。一TEasyTfxVector为模板，5RBsX01(含限制性内切酶BamHI)、3RBsX02为引物扩增出117bp基因片断；以这两个基因片段为模板，5RBsX0l、3RBsX01为引物，采用基因拼接技术(SOE)构建了长度为628bp的木聚糖酶杂合基因，获得了含杂合基因的重组质粒pGEM。-TEasyHXVector。将经BamHI和XhoI双酶切获得

3、的杂合基因连接到经相同酶切的pET30a(+)表达载体中，并导入到EcoliBL21中表达。采用RBB．木聚糖水解透明圈技术，获得了基因工程菌E．coliHX菌株。在LB培养基中37℃下培养16h，该基因工程菌单位发酵液酶活性为288U／ml；与出发菌株的枯草芽孢杆菌2和褐色高温单孢菌TF及其基因工程菌E．coliBSX和EcoliTfx相比，酶活分别提高了3．77倍、6．50倍、27．29倍和9．42倍。酶学特性研究表明．杂合木聚糖酶HX分子量为27．2kDa，最适反应温度为50～60℃；模拟饲料制粒温度，经70℃、80℃和90℃处理2min，H

4、X存活率分别为96％、74％和48％，而亲本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分别为17％、9％、2％和78％、40％、12％，与BSX和Tfx相比，HX分别提高了4。65倍、7。22倍、23．00倍和O。23倍、0．85倍、3．OO倍。杂合木聚糖酶HX最适反应pH为6．O～7．0；最稳定pH为5．O～7．0。在37"C、pH6．0(模拟动物小肠生理环境)条件下，相同酶活的HX在RBB．木聚糖平板上的水解透明圈显著大于木聚糖酶Tfx和BSX：在pH6．0、40℃保温40min，HX使木聚糖粘度下降15．15％，而BSX和Tfx分别下降9．09％和0％。关

5、键词微生物：RBB．木聚糖：木聚糖酶：基因克隆：杂合木聚糖酶基因构建：表达；热稳定性耐热术聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究博士学位论文AbstractThethermostabilityofxylmrlase(E．C．3．2．1．8)iscriticaltoitsactivity．Thefeedreachestemperaturesbetween70～80℃duringthepelletingprocessbystemadditionintheconditioneLandtheprocesscall，therefore，leadtol

6、ossesinactivityofaddedxylanase．Itbecomesaveryimportantissuet0increasethethermostabilityofxylanase．111epurposeofthisstudywastoscr∞nthewildstrainsofxylanaseproducingmicrobes，toclonexylanasegenesoreDNA，toexpressthesegenesintheEcoliusingpET30(a’卜卜asexpressionvector,toassesstheprop

7、ertiesofdifferentlyexpressedxylanases．Furthermore，thehybridxylanasegeneH)('whichcallexpressthermostablexytanase，wasdesignedandconstructedusingSplicingbyOverlapExtension(SOE)technique，andexpressedinEcoli．Thebiochemicalpropertiesofpurifiedhybridxylanase，particularlyintheenhanced

8、stabilityathighertemperatureascomparedtothoseoftheparents，wer