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时间:2019-05-22
《耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究》由会员上传分享,免费在线阅读,更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、浙江大学博士学位论文耐热木聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究姓名:孙建义申请学位级别:博士专业:特种经济动物与饲养指导教师:许梓荣20030501耐热末聚耱酶杂台基因的构建、表达噩产物的酶学特性研究博士学位论文在pH5.0~7.0之间酶活性较高,pH4.0~7.0之间较为稳定;Tfx的最适反应pH为6.0,在pH5.0~7.0之间酶活性较高,pH5.0~9.0之间较为稳定。通过对木聚糖酶BSX和Tfx的成熟肽氨基酸序列同源性和二级结构单元的分析,设计并构建了耐热杂合木聚糖酶分子,通过表达获得了耐热杂合木聚糖酶基因工程菌EcoliHX,分
2、离和纯化了表达产物,进而系统研究了其酶学特性。以pGEM*.TEasyBSXVector为模板,5RBsX02、3RBsX01(含限制性内切酶XhoI)为引物扩增出532bp基因片断;以pGEM。一TEasyTfxVector为模板,5RBsX01(含限制性内切酶BamHI)、3RBsX02为引物扩增出117bp基因片断;以这两个基因片段为模板,5RBsX0l、3RBsX01为引物,采用基因拼接技术(SOE)构建了长度为628bp的木聚糖酶杂合基因,获得了含杂合基因的重组质粒pGEM。-TEasyHXVector。将经BamHI和XhoI双酶切获得
3、的杂合基因连接到经相同酶切的pET30a(+)表达载体中,并导入到EcoliBL21中表达。采用RBB.木聚糖水解透明圈技术,获得了基因工程菌E.coliHX菌株。在LB培养基中37℃下培养16h,该基因工程菌单位发酵液酶活性为288U/ml;与出发菌株的枯草芽孢杆菌2和褐色高温单孢菌TF及其基因工程菌E.coliBSX和EcoliTfx相比,酶活分别提高了3.77倍、6.50倍、27.29倍和9.42倍。酶学特性研究表明.杂合木聚糖酶HX分子量为27.2kDa,最适反应温度为50~60℃;模拟饲料制粒温度,经70℃、80℃和90℃处理2min,H
4、X存活率分别为96%、74%和48%,而亲本木聚糖酶BSX和Tfx存活率分别为17%、9%、2%和78%、40%、12%,与BSX和Tfx相比,HX分别提高了4。65倍、7。22倍、23.00倍和O。23倍、0.85倍、3.OO倍。杂合木聚糖酶HX最适反应pH为6.O~7.0;最稳定pH为5.O~7.0。在37"C、pH6.0(模拟动物小肠生理环境)条件下,相同酶活的HX在RBB.木聚糖平板上的水解透明圈显著大于木聚糖酶Tfx和BSX:在pH6.0、40℃保温40min,HX使木聚糖粘度下降15.15%,而BSX和Tfx分别下降9.09%和0%。关
5、键词微生物:RBB.木聚糖:木聚糖酶:基因克隆:杂合木聚糖酶基因构建:表达;热稳定性耐热术聚糖酶杂合基因的构建、表达及产物的酶学特性研究博士学位论文AbstractThethermostabilityofxylmrlase(E.C.3.2.1.8)iscriticaltoitsactivity.Thefeedreachestemperaturesbetween70~80℃duringthepelletingprocessbystemadditionintheconditioneLandtheprocesscall,therefore,leadtol
6、ossesinactivityofaddedxylanase.Itbecomesaveryimportantissuet0increasethethermostabilityofxylanase.111epurposeofthisstudywastoscr∞nthewildstrainsofxylanaseproducingmicrobes,toclonexylanasegenesoreDNA,toexpressthesegenesintheEcoliusingpET30(a’卜卜asexpressionvector,toassesstheprop
7、ertiesofdifferentlyexpressedxylanases.Furthermore,thehybridxylanasegeneH)('whichcallexpressthermostablexytanase,wasdesignedandconstructedusingSplicingbyOverlapExtension(SOE)technique,andexpressedinEcoli.Thebiochemicalpropertiesofpurifiedhybridxylanase,particularlyintheenhanced
8、stabilityathighertemperatureascomparedtothoseoftheparents,wer
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