利用cDNAEST序列大规模开发内含子多态性标记的研究

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1、浙江大学农业与生物技术学院博士学位论文利用cDNA/EST序列大规模开发内含子多态性标记的研究姓名：杨龙申请学位级别：博士专业：作物遗传育种指导教师：吴为人20080401学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解堑鋈盘堂有关保窝、使用学像论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权鲨窿茎登可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。(保密的学位论文在解密后适用本授权书)学位论文作者签名：辛砭亨彩导师签名：名乃L签字

2、日期：W年臼厶日签字目期：痧薛么胃加醋摘要随着大规模植物功能基因组测序项星的进展，产生了大量的表达序列标签(EST)序列。内含子广泛分布于真核生物基因组中，其变异程度通常比编码序列高得多。利用内含子上的多态性，包括内含子长度多态性(ILP)和内含子单核苷酸多态性(ISNP)，可开发成分子标记，称为内含子多态性(IP)标记。内含子在基因中的位置在物种间相对保守，因此通过将某个植物的EST序列与模式植物水稻或拟南芥的同源基因进行比较，可

3、以推断该植物EST上的内含子位置(馨相邻外显子之闻的连接点)。在所推测的内含子位置两侧的EST序列上

4、设计一对引物，就能够在该植物的基因缌中扩增出包含所预测的内含子的片段并检测到该内含子中存在的多态性，从而开发出IP标记。也就是说，这样的弓l物具有开发出IP标记的潜力，因此我们称之为潜在的内含子多态性(PIP)标记。基于上述原理，本研究进行了大规模的PIP标记开发，构建了PIP数据库，并在棉花中进行了ILP标记的开发和应用，同时对ISNP的检测方法进行了探讨。主要结果如下：．1、在59个物种中开发了57，658个PIP标记。2、建立了一个基于互联网的PIP标记数据库(http：艇bi。毒珏．edu。c啦g印碴)。该数据库提供以下功能

5、：1)介绍PIP标记开发的流程和方法；2)查询或下载PIP标记；3)对用户提交的cDNA／EST序列进行PIP引物的在线设计；4)比较不同物种间的PIP标记的同源性。3、对PIP标记的电子PCR分析表明，根据模式植物拟南芥对苜蓿及白杨内含子的预测的准确率分别达到99．40％和98．71％，说明内含予位置确实非常保守。4、对模式植物基于自身开发的PIP标记的比较分专厅显示，水稻两个亚种(粳稻品种日本晴和籼稻品种93一11)之间及拟南芥两个生态型(Columbia和Landsbe耀)之间ILP频率分别为17．98％和18。61％，ISN

6、P频率分别为51。22％和53．18％，说明植物中内含子多态性水平是非常高的，能够满足实际应用的需要。5、合成了220对棉花PIP标记引物，对19个栽培棉和25个野生棉材料进行PCR分析，发现92．27％的引物能得到预期的扩增产物，65．02％获得单一条带，94．09％的扩增产物包含内含子。在栽培棉(包括陆地棉和海岛棉)中ILP频率仪为3．18％，僵野生栋中达到47．78％，ILP标记的PIC值变化在0。061--0．72l之间，平均为O．34。6、霜开发的棉花ILP标记对25个野生棉种进行聚类分析，发现ILP标记能严格区分出A、B

7、、C、D、E、F和G七种染色体组以及二倍体和罂倍体，说明ILP标记可以有效地应用于棉花分类和进化的研究。7、对利用TILLING原理检测ISNP进行了探索，并在技术上进行了简化(称为simTILL烈G)，提出了在分离群体中应用simTILLING技术检测ISNP标记的原理。8、对利用引物长度差异的PCR检测SNP的方法进行了尝试。利用该方法在棉花中开发了6个EST-SNP标记。关键词：杰含子多态性，分子标记，数据库2AbstractWiththeprogressmadeinlarge—scaleplantfunctionalgeno

8、mesequencingprojects，agreatamountofEST(expressedsequencetag)dataisbecomingavailable．Intronsarewidelydistributedineukaryoticgenomesandaremuchmorevariablethancodingsequences．Polymorphismsinintrons，includingintronlengthpolymoiphism(ILP)andintronsinglenucleotidepolymorphis

9、m(ISNP)，canbedevelopedasmolecularmarkersnamedintronpolymorphism(IP)．Thepositionsofintronsingenesarerelativelyconserva