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《p53与CK双重免疫组化染色法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。
1、诊断病理学杂志2004年12月第11卷第6期·437·p53与CK双重免疫组化染色法陈 罡,周英琼,侯巧燕,陈 峰 (桂林医学院病理教研室,广西桂林 541001)[关键词]p53;CK; 免疫组化; 染色方法[中图分类号]R446[文献标识码]B[文章编号]1007-8096(2004)06-0437-02 双重染色法是指在一张切片上做两种不同染色的方法,1.2 方法如免疫组化和免疫组化、免疫组化和原位杂交、免疫组化和1.2.1 预实验 p53单克隆抗体、CK多克隆抗和双重免疫[1][2]特殊染色及DNA染色和免疫组化等。其中双重免疫组组化染色Kit为美国MAXIM公司产
2、品,购自福州迈新生物技化染色是在同一张切片上显示两种不同的抗原,这种方法可术开发公司。根据单染情况,选择适合的组织做预实验,将以了解不同细胞、组织之间与相关抗原的相互关系,甚至可同一组织连续切片4张分为4组,分别先后进行p53、CK染以了解同一种细胞内抗原之间的相互关系,以及有关抗原在色,其中每种染色都分别使用不同的显色方法,如加链霉菌细胞的合成、转运及代谢途径,将形态观察与功能分析结合抗生物素—碱性磷酸酶(streptavidinalkalinephosphatase),用[3]起来。本实验成功地在一张切片上显示鼻咽部低分化鳞52溴242氯23吲哚磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝(
3、52bromo242chlo2状细胞癌组织p53与细胞角蛋白(cytokeratin,CK)的表达,用ro232indolyl2phosphate/nitro2blue2tetrazolium,BCIP/NBT)显色,呈以观察CK表达的癌细胞是否同时表达p53,现介绍如下。紫黑色;如加链霉菌抗生物素—过氧化物酶(streptavidinper2oxidase),则用32氨基292乙基卡唑(32amino292ethylcarbozole,1 材料与方法AEC)显色,呈橙红色(表1):最后根据着色情况,选择第1组1.1 材料32例鼻咽部低分化鳞癌组织,选自桂林医学院方法将着色深
4、的p53(BCIP/NBT显色)定为首先显色的一抗。附院病理科2003201—2004201间标本,单染p53、CK均为阳性。表1 预实验方法及结果项目第一次抗体第一次显色方法第二次抗体第二次显色方法结果p53阳性为胞核紫黑色,CK阳性为胞质橙红色,显色清第1组p53BCIPPNBTCKAEC晰,层次分明p53在第一次显色时为橙红色,第二次显色后原来的橙第2组p53AECCKBCIPPNBT红色被紫黑色覆盖,无法区分何种抗体上色CK在第一次显色时为淡黑色,但第二次显色后原来的第3组CKBCIPPNBTp53AEC淡黑色消失,被橙红色替代,无法区分何种抗体上色CK在第一次显色时
5、为橙红色,但是第二次显色后原来第4组CKAECp53BCIPPNBT的橙红色被紫黑色覆盖,无法区分何种抗体上色1.2.2 双重染色步骤 参考试剂盒说明书并有所改进:①微镜下观察10～30min,阳性显色为紫黑色,PBS冲洗4×5前期处理:包括组织及时适当取材、10%中性福尔马林充分min;lv•每张切片加1滴或50μl双染增强液,室温下孵育10固定和适宜的石蜡包埋,完整切片(厚度3～5μm),载玻片需min,PBS冲洗3×5mim;lw•每张切片加1滴或50μl非免疫性经清洗和防脱片处理;②烘片:组织切片在55～60℃温箱中动物血清,室温下孵育10min,PBS冲洗1次;lx
6、•每张切片加1过夜;③石蜡切片脱蜡和水化后,PBS(pH714)冲洗3×5min;滴或50μl的第一抗体CK,室温下孵育60min,PBS冲洗3×5脱蜡要彻底,如果室温较低时脱蜡可在37℃温箱中进行或适min;ly•每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体,室温当延长时间;④抗原修复:高温修复(柠檬酸)后,PBS冲洗3下孵育10min,PBS冲洗3×5min;lz•每张切片加1滴或50μl×5min;⑤每张切片加1滴或50μl过氧化物酶阻断溶液,以链霉菌抗生物素—过氧化物酶溶液,室温下孵育10min,PBS阻断内源性过氧化物酶的活性,室温下孵育10min,PBS冲洗冲洗3
7、×5min;l{•每张切片加2滴或100μl新鲜配制的AEC3×5min;⑥每张切片加1滴或50μl非免疫性动物血清,室温溶液,在显微镜下观察5～10min,阳性显色为橙红色;l
8、•流水下孵育10min,PBS冲洗1次;⑦每张切片加1滴或50μl的第冲洗,苏木精复染,流水冲洗返蓝,直接用水性封片剂封固,一抗体p53,室温下孵育60min,PBS冲洗3×5min;⑧每张切显微镜下观察。片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体,室温下孵育10min,PBS冲洗3×5min;⑨每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生
