实验三简单染色法与革兰氏染色法

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1、实验三简单染色法和革兰氏染色法(—)细菌的简单染色法1实验目的1.1熟悉普通光学显微镜的构造及各部分的功能L2学习微生物涂片、染色的基本技术13掌握细菌的简单染色法1.4初步认识细菌的形态特征,学习油镜的使用方法和无菌操作技术2实验原理细菌的涂片和染色是微生物学实验中的一项基本技术。细菌的细胞小而透明,在普通的光学显微镜下不易识别,必须对它们进行染色。利用单一染料对细菌进行染色，使经染色后的菌体与背景形成明显的色差,从而能更清楚地观察到其形态和结构。此法操作简单，适用于菌体一般形状和细菌排列的观察。用于生物染色的染料主要有碱性染料、酸性染料和中性染料三大类。一般使用碱性染料进行简单染色。碱

2、性染料的离子带正电荷能和带负电荷的物质结合。因细菌蛋电质等电点较低，当它生长于中性、碱性或弱酸性的溶液中时常带负电荷,因此碱性染料的染色部分很容易与细菌结合使细菌着色。经染色后的细菌细胞与背景形成鲜明的对比，在显微镜下更易于识别。常用作简单染色的燃料有美蓝、结晶紫、碱性复红或孔雀绿等。酸性染料的离子带负电荷，能与带正电荷的物质结合。当细菌分解糖类产酸使培养基pH值下降时,细菌所带正电荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料着色。染色前必须固定细菌，其目的有二：一是杀死细菌并使菌体黏附于玻片上；二是增加对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。3实

3、验材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物,大肠杆菌24h营养琼脂斜面培养物。3.2染色剂草酸披结晶紫染液，番红染液。3.3仪器或其他用具显微镜、擦镜纸、接种环、酒精灯、载玻片、吸水纸、无菌牙签等。涂片一»干燥—>染色—洗5步骤5.1涂片在洁净无脂的载玻片中央滴一小滴生理盐水或无菌蒸懈水，用无菌操作方法2从菌种斜面挑取少量菌体与水滴充分混匀,涂成薄膜,涂布面积约1〜1.5cm。若用菌悬液:或液体培养物除片可用接种环挑取2-3环直接涂布于载玻片上。注意生理盐水（蒸f留水）和取菌时不宜过多且涂抹要均匀z不宜过厚。5.2干燥室温自然干燥。也可以将涂面朝上在酒精灯上方稍微加热，使其干

4、燥。但切勿离火焰太近z因温度太高会破坏菌体形态。如用加热干燥，固定与干燥合为步。5.3固定手执载片一端，使涂菌的一面向上,将载片通过微火2〜3次。在火上固定时，用手摸涂片反面,以不烫手为宜。不能将载片在火上烤,否则细菌形态毁坏（图4—10c）o5.4染色将涂片平放于玻片搁架上滴加「2滴染色液覆盖于涂菌处染色约2min（图4—10d）o5.5水洗倾去染色液，斜置载片，用自来水的细水流由载片上端流下,不得直接冲在涂菌处，直洗至从载片上流下的水中无染色液的颜色为止（图4—10e）o5.6干燥自然晾干或用吸水纸轻轻地吸干,注意不要擦掉菌体（图4—10f）o5.7镜检待标本完全干燥后,先用低倍镜和高

5、倍镜观察，将典型部位移至视野中央,再用油镜观察。6结果绘制单染色后观察到的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的形态图。（二）革兰氏染色法1目的了解革兰氏染色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要性。1.2学习掌握革兰氏染色技术,巩固学习光学显微镜的使用方法。2原理革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学家ChristainGram氏创立的，革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-）两大类。革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法。革兰氏染色法的基本步骤是：先用初染剂结晶紫进行初染，再用碘液媒染，然后用乙醇（或丙酮）脱色,最后用复染剂（如番红）复染。经此方法染色后，细胞保留初染

6、剂蓝紫色的细菌为革兰氏阳性菌;如果细胞中初染剂被脱色剂洗脱而使细菌染上复染剂的颜色（红色）,该菌属于革兰氏阴性菌。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G・）和革兰氏阴性菌（G+）两大类，是细菌学上是常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G-菌和G+菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。实际上,当用结晶紫初染后,像简单染色法一样，所有细菌都被染成初染剂的蓝紫色。碘作为的结媒染剂，它能与结晶紫结合成结晶紫■碘的复合物，从而增强了燃料与细合力。当用脱色剂处理时,两类细菌的脱色效果是不同的。革兰氏阳性细菌的细胞壁主要由肽聚糖形成的网状结构组成，壁厚、类脂质含量低,用乙醇（

7、或丙酮）脱色时细胞壁脱水、使肽聚糖的网状结构孔径缩小，透性降低，从而使结晶紫・碘的复合物不易被洗脱而保留在细胞内，经脱色和复染后仍保留初染剂的蓝紫色。革兰氏阴性菌则不同,由于其细胞壁肽聚糖层较薄、类脂含量高,所以当脱色处理时，类脂质被乙醇（或丙酮）溶解，细胞壁透性增大，使得结晶紫-碘的复合物比较容易被洗脱出来，用复染剂复染后，细胞被染上复染剂的红色。3材料3.1菌种金黄色葡萄球菌约18h营养琼脂斜面培养物，大肠杆菌24h