PCR法鉴别哺乳动物胚胎性别的研究

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1、安徽农业大学硕士学位论文PCR法鉴别哺乳动物胚胎性别的研究姓名：洪桂云申请学位级别：硕士专业：动物遗传育种与繁殖指导教师：陈宏权;章孝荣2003.6.1摘要本实验建立了用聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction，PCR)技术体外扩增哺乳动物SRY特异序列鉴别哺乳动物胚胎性别的方法。依据牛、山羊、兔、猪等哺乳动物Sry基因高度同源性设计一对SRY引物，两条引物均为22个碱基，对公牛的SRY特异的163bp序列进行体外扩增。从公、母牛的组织或血液提取基因组DNA，用作PCR扩增基因组DNA的模板，同时在立体显

2、微镜下收集羊一兔异种克隆胚胎，先用O．145mol／LNaCI冲冼2次，再移入20此胚胎处理液中(t0mmol／LTfis-HCIpH8．3，50mmol／LKCl，2mmogLMgCZ2，O．45％NP．40，O．45％Tween-20，0．1ttg／I．tL蛋白酶K)，将羊-兔异种克隆胚胎及其处理液在55"C水浴作用60min，然后将此胚胎溶解物直接作为PCR扩增胚胎DNA的模板。按照析因设计，建立最适PCR扩增牛基因组DNA和羊-兔异种克隆胚胎DNA条件：反应体系中加入无MgCl2的缓冲液和3X2X3因子组合浓度的SRY

3、引物(每种引物浓度分别为：0．1pmol／L，0．3pmol／L，0．5lamol／L)，dNTPs(浓度分别为：0．1mmoI／L，0．2m．raol／L)芹n'MgCl2(浓度分别为：0．75mmol／L，1．5mmol／L，2．25mmol／L)；模板为公牛基因组DNA(2p．L约100ng)或羊．兔异种克隆胚胎溶解物20I．tL；2IUTaqDNA聚合酶。反应体系为50此。反应在微机控制Flexigene型PCR仪上进行，反应参数为：95℃预变性5min后，按95℃变性1min，58℃退火1rain，72℃延伸1min

4、，进行30或35个循环后，72℃延伸9min，于4"C结束反应。扩增产物在2％琼脂糖凝胶上电泳，用PCRMarker作分子量标准，紫外灯下观察，最适PCR反应条件为扩增出最强的SRY产物带而无非特异性扩增带出现时的反应条件。结果表明：SRY引物扩增牛基因组DNA时，PCR最适条件为：O．1扯mol／LSRY引物，0．1mmo

5、几dNTPs和1．5mmol／LMg”，退火温度为58。C，循环次数30次：SRY引物扩增胚胎DNA时，PCR扩增最适条件为：0．5I_tmol／LSRY引物，0．1mmol／LdNTPs和1．5mmol

6、／LMg“，退火温度为58℃，循环次数35次。采用PCR扩增牛基因组DNA最适条件分别扩增了黑白花奶牛9头(早6，63)、皖北黄牛1l头(早3，68)、波尔三羊3只(早2，61)、兔4只(早l，63)和猪7头(早3，64)的基因组DNA。所有雄性样品中均出现清晰可见的特异DNA扩增带，而雌性样品和空白对照中无扩增片段出现。同时采用PCR扩增羊．兔异种克隆胚胎DNA最适条件扩增了15个羊-兔异种克隆胚胎DNA(4个胚胎的供体为公羊，11个胚胎的供体为母羊)，所有以公羊为供体的羊-兔异种克隆胚胎样品均出现清晰可见的特异DNA扩增条

7、带，而以母羊为供体的羊．兔异种克隆胚胎样品和空白对照中无扩增片段出现。结果表明PCR法可以用来鉴别哺乳动物的性别以及鉴别哺乳动物胚胎的性别，而且用此法鉴定哺乳动物早期胚胎性别具有相对简单、快速、费用低和准确率高等优点。本实验还采用设计的性别鉴定引物，按照最优PCR扩增胚胎DNA条件配制了PCR性别鉴定试剂盒。经实验该性别鉴定试剂盒使用准确性高，可降低污染，方法简便易行，成本低，在生产实践中有很大的实用价值。关键词：哺乳动物胚胎PCR法性别鉴定StudyonSexIdentificationinMammalsEmbryosWit

8、hPolymeraseChainReactionPostgraduate：Gui—YunHongTutor：Prof．Hong—QuanChenProf．Xiao·RongZhang(Collegeofanimalhusbandryandaquiculture，AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei，230036)AbstractAPolymeraseChainReactionrPCR)-basedmethodforsexdeterminationofmammalsembryosbyamplific

9、ationofmammalsSRY-specificsequencewasestablished．Apairofprimersof22basesinlengthweredesignedbasedonregionsofsequencehomologyamongcattle，go