白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建

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1、浙江大学博士学位论文白菜雄性不育相关基因CYP86MF的功能验证及其人工不育系的创建姓名：余小林申请学位级别：博士专业：蔬菜学指导教师：曹家树2002.5.1堕：!兰垡丝苎!!墨堡丛尘堕塑苎苎塑竺鲨!!竺!塑些!!鉴韭丝!!△!!：堕墨坚型些———一摘要b釜属(曰rmsJc口)作物是我国栽培面积最人，总产母最高的一类蔬菜与油料作物。同时它也是杂科，优辫利H】最为背遍的一类作物，其雄性不育的选育及其应j}

2、基础的研究深受人们重视。近一个雌纪以来对植物雄性不育的研究．国内外学者做了人Irt的N．论和实验的

3、探讨，住方法平¨指导思想上都有了明显的进步，不仅取得了一些重要的研究进展，还带动了杂种优势住生产中的厂泛廊j{J．产生了巨大的经济效益和社会效益。但是，雄性不育产生的机制仍然是一个尚未完全解开的谜，目前对其的认识是零散和不完全的，还有许多问题需要深入研究。随着现代生物学，尤其与白菜核雄性不育相关的编码细胞色素P450基因CYP86MF。该基冈具有一个完整的k1578bp的开放阅读框，经GenBankBLAST查询表明，CYP86MF与位于拟南芥第一条染色体上的编码细胞色素P450基冈CYP86C4核苷

4、酸序列有85．3％的同源性，氨基酸同源率为84．9％；Nor／bern验证表明CYP86MF基因在白菜两用系不育株中的表达受到了明显地抑制，并且该基因在花蕾中特异表达，而在叶片和茎中不表达。为进一步了解本实验室获得的CYP86MF基冈的生物学功能，在建立了白菜和菜心的高效再生体系，以及构建了植物表达载体的基础上，我们采刚反义技术将可育株高表达的CYP86MF基因中约460bp的片段导入正常可育白菜和菜心●Bcampestrisssp．chinensis(L．)Makinovat,parachinens

5、is(Bailey)TsenetLeel中，得到了130多株转化植株，其中开花结果的有37株，除2株为嵌合的不育株以及3株的花器官畸形(花朵变人、花瓣变窄以及嵌套花)以外，其余的转基冈植株花器官外观形态正常，但单株白交不能正常结实，蕾期授粉亦然。由此我们进行]’转基冈植株的花粉萌发试验，结果显示，转基因植株的花粉不能止常萌发，而1r转化对j{{{株的花粉萌发率可达25％～30％。由此，我们分析了转基因不育植株与止常可育植株及其两州系材料之问CYP86MF基田的发达特征，对转基嘲植株及其对照株之间的小孢

6、子的形态和细胞发育过删进行，观察，比较了它们之间有关生理生化指标的差异，从而为探讨CYP86MF基冈在芸盛属植物小孢J二发育过鹎!中的作_L}j机制提供了一些信息。I主要研究结果如F：(1)通过不同浓度的激素配比以及来川不同外植体的筛选，提i15了一个白菜离体培养f}}，r频率较商的培养基配方(1，2倍浓度NH。+的MS培养基的盐类及维生素+2％蔗糖+0．8％琼脂+2mg／LBAP+O．45mg／LNAA+7．5mg／LAgN03+80mL／L椰子汁)，人幅度提高丁植株的f≮7t频率．达刮84．8％以

7、上。成莳周J9

8、人人缩短。于叶．f"l+柄外植体接种历，最Ei的仪需6dU『】l·，分化fil不定芽，从接种刨再生凿的移栽最快的约需40d，平均一批约需50d，再生植株移就的成活牢达剑博士学位论文门某雌州小育相关牡川CYP86MF的JJJ能验证及R：Z-r小甘彖的创业95％以L，达剑-『高频帙谜的要求。该培养基对白菜类蔬菜的-4：,Nr协种订着较J'的适廊性。此外，还发现广1荣类蔬菜的再生特性具有较强的基冈裂背景，其中青梗类向菜的不定自再生能力仇¨71梗类n荣。(2)建立了改良的菜心离体培养再生体系，

9、其分化及生艮培养基的配方为：I／2倍浓度NH4‘的MS培养基的盐类及维生素+2％蔗糖十O．8％琼脂+2m∥LBAP4-o75～10mg／LNAA+7．5mg／LAgN01+80mL，L椰f汁。(3)杜J建了反义CYP86MF錾因的CaMV35S组成刊表达载体pBl35S．AMF和A9缄毡膳组织特异型表达裁体pBIA9．AMF。检测鉴定后，分别将它们导入农杆凶LBA4404川EHAl05菌株中。(4)经过对Fl菜和菜心Kan筛选浓度的确定、预培养和共培养时问的筛选，以及不同农杆菌菌株的比较，建立了Sou

10、thern印迹杂交叶陛频率高达248％的白菜高教遗传转化体系。具体操作为：将子叶柄．子叶外植体在预培养基上预培养3d后，用LBA4404，(pBl35S—AMF年ffpBIA9一AMF)感染10～15rain，在灭菌滤纸上吸干菌液，置丁共培养培养基上培养2d。随后将外植体转入含10m∥LKan的选择分化培养基上诱导不定芽，3周转瓶一次，当抗陛幼苗K至2~3cm时．在愈伤组织处切卜幼曲，置r生根培养基上诱导不定根，20d左右不定根长成后，开瓶炼凿，继而移栽