沙田柚3x、4x与红江橙4x多倍体基因组变异及其DNA甲基化分析

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1、摘要沙田柚(3x、4x)与红江橙(4x)多倍体基因组变异及其DNA甲基化分析细胞生物学硕士研究生：何波指导老师：梁国鲁研究员多倍化是植物进化的主要推动力，常常伴随发生大量遗传与表观遗传变异，使植物出现新的表型，如抗旱、抗病虫、花期、器官人小等，使植物能够更好的适应生存环境的需要。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传修饰形式，普遍存在于高等植物中，并在控制基因表达、维持基因组的稳定性等方面发挥重要作用。本试验一方面运用扩增片段长度多态性(Amplifiedfragmentlengthpolymorphism，AFLP)分析沙田柚和红江橙在多倍化过程中基因组结构的变异；另一方面运用甲基化敏感扩增多

2、态性(Methylationsensitiveamplifiedpolymorphism，MSAP)对其DNA甲基化水平和遗传模式进行统计分析，期望可以从基因组结构和DNA甲基化两个方面初步探讨柑橘多倍体的遗传与进化模式，对果树多倍体遗传特性、杂种优势形成以及倍性育种等方面的研究具有重要意义，其主要结果如卜．：‘沙田柚天然和人工多倍体基因组AFLP分析结果表明：18对引物共扩增出912个位点，其中多态性位点为382个，占41．89％。按与二倍体差异位点数由多到少排序，依次为X14(266)、X18(252)、X8(249)、X5(243)、X1(242)、X7(241)、X6(240)、X4

3、(239)、X17(213)、X3(213)、X15(207)、X12(198)、X16(195)，变异率在21％～29％之间，表明沙田柚多倍体基因组在多倍化中发生了大量变异，推测是多倍体表型变异的主要原冈之一。人工多倍体基因组变异率较天然的高，起源方式相同的多倍体基因组相似度更高，暗示了多倍体基因组的变异不完全是一个随机事件。天然红江橙多倍体基冈组AFLP分析结果显示：18对共扩出2107条带，平均每对引物117条，其中，差异带180条，I与总扩增数的8．21％，条带增加的位点有43个，I’总差异位点数的23．89％，条带缺失的位点有137个，l与76．11％。总体来看，各四倍体单株与二倍

4、体对照的总差异位点数大致相当，X19为61个(8．74％)，X20为57个(8．14％)，X2为62个(8．74％)，较之沙田柚多倍体大为降低，表明不同物种对基冈组加倍的耐受力不尽相同。分析差异位点出现位置发现，同时有条带增加的位点有8个，而同时缺失的位点达33个，占总差异位点数的68．3％，表明多倍体基冈具有较高的相似度，结合变异率较低，推测红江橙四倍体均由珠心胚加倍形成。沙田柚多倍体基冈组DNA甲基化分析结果显示，18对引物共扩出9688条带，其中甲基阳南大学硕十学伊论文化位点为2368个，包括全甲基化位点为1369个，半甲基化位点999个，多态性达24．4％。多倍体总甲基化率在21．6

5、％～30．2％间，平均为23．8％。与二倍体对照总甲基化率26．O％比较，多倍体总体上差异不人。但多倍甲基化模式较二倍体进行了大量调整，包括单态性位点(A型)，1413个(36．2％)；去甲基化类型(B型)，954个(24．5％1；过或超甲基化类型(C型)1057个(27．1％)；次甲基化类型(D型)437个(12．3％)。主要发生了过或超甲基化，被认为是抑制某些基因的表达；其次是去甲基化，被认为是激活某些基冈的表达。对红江橙多倍体及其二倍体对照基因组DNA进行甲基化分析，18对引物共扩出2245个位点，其中，甲基化位点为644个，包括328个全甲基化位点和316个半甲基化位点。四倍体各单株

6、总甲基化率分别为X19(30．64％)、X20(31．01％)和X2(28．24％)，较二倍体的25．04％有所提高；全甲基化率分别为X19(15．23％)、x20(15．05％)、x2(14．2l％)，较二倍体的13．99％略有提高。各四倍体单株甲基化模式均有人量调整，其中以过或超甲基化类型(C型)为主，占33．29％，其次是去甲基化(B型)，占13．45％，最少的是次甲基化(D型)，占11．98％，多倍体通过调整DNA甲基化模式进行基因表达的调控。综上所述，沙田柚与红江橙多倍体基闪组结构较二倍体均发生了大量变异，推测为同源基冈重组、外源基冈的导入所致。多倍体DNA甲基化模式进行了人量调整

7、，引起基因的表达与调控变异，从而使多倍体植物在表型、抗性等方面发生改变。关键词：沙田柚红江橙多倍体基因组变异DNA甲基化AbstrctAnalysisofGeneticVariationandDNAMethylationofPolyploidyinCitrusgrand&Osb．CV．Shatianyou(3x，4x)andCitrussinensisOsb．CV．Hongjiang(4x)Candidate