树鼩CD25分子的克隆、鉴定和表达分析

《树鼩CD25分子的克隆、鉴定和表达分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

1、摘要乙肝已成为严重危害人类健康的重点疾病，每年约50万人死于由乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus，HBV)感染引起的肝硬化、肝癌。HBV研究一直面临缺少合适的动物模型，阻碍了其致病机理、药物筛选、疫苗开发等研究的进程。黑猩猩能有效感染HBV，因数量稀少、涉及伦理学等难以作为实验动物用于肝炎研究。树嗣(Tupaiabelangei)是一种与灵长类亲缘关系较近的哺乳动物。因其体积小易于实验室饲养，对多种人类病毒如单纯疱疹、轮状病毒、HCV、HBV易感，被认为是研究人类感染性疾病如HBV的一种理

2、想的动物模型。如何有效地清除HBV和治疗慢性乙型肝炎感染仍然是医学界一个重要课题。打破机体对HBV的免疫耐受，激发病毒特异的免疫应答是清除体内HBV从而治愈乙肝的根本发展方向。研究发现CD4+CD25+调节性T细胞(Tregs)在HBV感染中可抑制病毒特异性CD8+效应T细胞功能，在HBV免疫耐受中起重要作用。白介素-2受体alpha链(CD25)是CD4+CD25+Tregs重要的表面分子和标志。利用树晌建立慢性HBV感染模型，以CD4+CD25+Tregs的CD25为靶点，通过抗体抑制CD4+C

3、D25+Tregs的功能，打破免疫耐受，可能为慢性HBV的发病机理、治疗和防治提供新的研究平台。为了充分利用树鼢作为慢性HBV感染的动物模型，我们以树鼢脾脏RNA为模板，对树嗣白介素．2受体基因alpha链(tsCD25)进行了RT-PCR，获得了一个816bp的开放阅读框。TsCD25cDNA编码一个由271个氨基酸组成的分子量为30，9kD的蛋白多肽。预测的tsCD25包含2个Sushi结构域、2个N一糖基化位点和多个O．糖基化位点。我们分析了tsCD25与其它物种CD25分子的系统发生关系。在

4、已知的哺乳动物分子中，tsCD25与猪、马、牛的一致性较低分别是59．5％、56．9％和52．4％，其和啮齿类CD25分子的一致性最低分别是小鼠57．4％、大鼠46．4％，其和灵长类CD25的同源性最高为65．3％．66．4％。我们分析了tsCD25与人CD25的氨基酸序列。tsCD25与人CD25的分子结构非常相似。在蛋白质分子的N端都含有长约21个氨基酸的信号肽，胞外区形成特征性的Sushi结构域。此外，含有19个氨基酸的跨膜区以及在蛋白质的C端都含有约13个氨基酸的胞内区。RT-PCR检测发现

5、，tsCD25mRNA分布于树晌的外周血、脾脏和肺。我们比较几种有丝分裂原发现PMA(豆蔻酰佛波醇乙酯)加ionomycin(钙离子载体)对树趵淋巴细胞的活化效果优于PHA(植物凝集素)，ConA(刀豆蛋白A)。第1页摘要RT-PCR检测发现，tsCD25mRNA受PMA和ionomycin刺激的调节。此外，还对tsCDl22和tsCDl32mRNA的组织分布和活化后淋巴细胞上的表达情况进行分析。这两个IL．2受体亚单位在肺、脾脏、外周血中也是可测的。除这些组织外，tsCDl32mRNA也分布于在树

6、晌的肝脏、肾脏和骨髓中。TsCDl22和tsCDl32mRNA同样受PMA和ionomycin刺激的调节。我们将tsCD25基因的编码区序列插入真核表达载体pcDNA3．1构建重组表达载体，并通过脂质体转染的方法使其在BALB／3T3细胞进行表达。然后通过G418筛选和有限稀释克隆的方法，建立了稳定表达tsCD25蛋白的单克隆细胞系。我们的结果为将来制备这个细胞表面蛋白的单克隆抗体，应用慢性感染的树嗣模型对CD4+CD25+Treg细胞进行功能性的研究提供了基础。关键词：乙型肝炎病毒；调节性T细胞；

7、树嗣；CD25；克隆；组织分布；表达第1页AbstractHepatitisBinfectionhasbeenaglobalhealthproblem．Itwasestimatedthatmorethan500，000peopledieannuallyduetoHBVassociatedliverdiseasessuchascirrhosisandhepatocellularcarcinoma．ResearchonchronicviralhepatitisBinfectionhasbeenfaced

8、withdi伍cultiesthatdeficiencyofsuitableanimalmodelhindertheproceedingontheapproachofHBVpathogenesisaswellasantiviraldrugscreeningandvaccineresearch．ChimpanzeescanbeefficientlyinfectedwithHBV,however，chimpanzeesarerestrictedintheiruseasex