RFLP微流控芯片技术基因突变检测系统的建立

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1、·英文缩略语·10中国医科大学研究生学位论文独创性声明本人申明所呈交的学位论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：牲日期：金虬中国医科大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解中国医科大学有

2、关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属中国医科大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为中国医科大学，且导师为通讯作者，通讯作者单位亦署名为中国医科大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容(保密内容除外)，以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：·中文论著摘要·RFLP．微流控芯片基因突变检测系统的建立刖吾肿瘤是威胁人类健康的重大疾病，发病率逐

3、年上升。在肿瘤的发生发展中会涉及多种基因的突变，因此突变基因的检测是肿瘤研究的重要课题，从而实现肿瘤的早期诊断和治疗。目前测序是检测基因的金标准，然而其耗时长价格昂贵等缺陷，不适合大规模筛查的需要，为此人们发展了相对简捷的方法进行测序前的检测。目前，常用的突变检测方法有PFLP(限制性片段长度多态性)、SSCP(单链构象多态性分析)、HA(杂合双链分析法)、ASA(等位基因特异性扩增法)、DHPLC(变性高效液相色谱)、MI(微卫星不稳定性)等，其中PCR．RFLP是一种以PCR扩增为基础进行特异性酶

4、切从而实现对基因点突变进行检测的方法，具有操作简单并且重现性好的优点，结合电泳可有效检测突变，应用十分广泛。但常规的电泳技术灵敏度相对较低，检测的假阴性率相对较高，不能对微量的突变样品进行有效筛查。微流控芯片分析系统(microfluidicanalysissystem)是分析化学、微机电加工、计算机、电子学、材料科学以及生物学等多学科交叉的产物，其目的是通过分析仪器的微型化和集成化，极大限度地把分析实验室的功能转移到便携的分析设备中，甚至集中到方寸大小的芯片上，因此又被称为微全分析系统(Miniat

5、urizedTotalAnalysisSystems，uTAS)或芯片实验室(Lab·on-a-chip，LOC)。微流控芯片具有样品用量少、分析速度快，灵敏度高，易于集成化自动化的特点，在生物样品的分析中有着显著的优势。微流控电泳芯片分析系统是在毛细管电泳基础上发展起来的更为优化的分析技术。其原理是以电场为驱动力，借助于离子或分子在电泳迁移或分配上的差异，从而实现对复杂试样中多种组分的分离。由于芯片的微通道面积．体积比显著增大，焦耳热能很快向四周溢散，所以可施加平板凝胶电泳难以达到的高场强，实1现对

6、样品快速、高效的分离检测。目前在芯片上已经实现了对核酸，蛋白质，氨基酸等多种生物分子的分析与分离，并有效用于多种基因突变的检测。大肠癌是发病率最高的恶性肿瘤之一，在我国已位居第3位，由于就诊时多为中晚期，导致死亡率明显增加，因此建立有效的早期检测的方法，以实现早期诊断、早期治疗是提高患者生存率的关键。大肠癌的发生与发展是一个多阶段、多个相关基因改变的累积过程，其中K-ras基因突变发生在腺瘤早期，对其检测有助于大肠癌的早期诊断。本研究拟以K．ras基因突变作为检测对象，将RFLP方法中的电泳检测过程移

7、植于到微流控芯片上进行，建立RFLP．微流控基因突变检测系统，实现对K．ras基因突变的高效快速检测。材料与方法一、微流控电泳芯片I)NA分离系统的建立1、芯片的制作用标准光刻和湿法刻蚀技术在玻璃基片上刻蚀出十字形微通道网络，采用热键合方法将其与盖片进行封接，在微通道末端粘接储液池，制成玻璃微流控芯片。2、共聚焦型激光诱导荧光检测装置的建立3、芯片通道表面的修饰。4、微流控电泳芯片DNA分离系统的优化(1)缓冲液组成成分的优化：常规选取1XTBE，2XTBE及3XTBE作为缓冲液，考察缓冲液对筛分系统

8、的影响。(2)筛分介质场强的优化：在相同筛分浓度下，考察不同场强120Wcm、180V／cm、240V／cm对分离效能的影响；(3)筛分系统浓度的优化：在相同的180Won场强下，考察不同浓度筛分介质1．0％、2．O％、3．0％HPC对筛分效能的影响。二、RFLP．微流控芯片基因突变检测系统的建立l、PCR-I江LP方法考察2经PCR扩增出含有密码子12位点的107bpDNA片段，利用MavI限制性内切酶特异性切割目的基因。琼脂糖电泳及微流控电泳芯片的检