黄瓜根际土壤细菌群落的16SrDNAPCR-DGGE分析

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1、2015（12）：33-37中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文黄瓜根际土壤细菌群落的16SrDNA-PCR-DGGE分析12，33*32赵柏霞　闫建芳　刘　秋　于基成　赵秀香123（大连市农业科学研究院，辽宁大连116036；沈阳农业大学植物保护学院，辽宁沈阳110161；大连民族大学生命科学学院，辽宁大连116600）摘　要：采用PCR-DGGE技术分析了接种枯萎病菌后黄瓜根际土壤细菌群落的动态变化。对黄瓜种植前、接菌前、接菌后发病、接菌后未发病以及接种清水（对照）共5份土壤样品直接提取其总DNA，用F338-GC/R518引物扩增1

2、6SrDNA基因的V3可变区，结合DGGE电泳条带分析样品的细菌群落组成及变化趋势。结果显示，接种枯萎病菌后，会引起黄瓜根际土壤中细菌数量及种类发生较大的变化，其中，接种枯萎病菌后Rhodococcusphenolicus（E1）、Clostridiumsp.（E3、E6）以及3种未培养细菌（E2、E4、E5）数量增加，另外2种未培养细菌（A1、A2）数量减少。关键词：根际微生物；PCR-DGGE；枯萎病菌；细菌群落黄瓜枯萎病〔Fusariumoxysporum（Schl）f.sp.2009；Chongetal.，2009；刘晓燕等，201

3、4）。cucumerinum〕是黄瓜生产上的一种顽固土传病害，为揭示枯萎病菌对黄瓜根际细菌群落的影响，是目前造成我国瓜类生产上大面积减产的主要原因本试验以黄瓜根际土壤总DNA为模板，采用PCR-之一，是黄瓜病害中最为严重、造成经济损失最大DGGE分析方法监测接种枯萎病菌后黄瓜根际土的病害之一（张宏宇等，2010，闫霜等，2011）。壤细菌的变化，试图阐述在枯萎病菌影响条件下其致病菌可以在土壤中存活多年，给该病害的防治土壤细菌群落的演替规律，为从根际微生物生态带来很大的困难。黄瓜枯萎病的发生及发病程度的角度理解枯萎病问题，进而为开展生物防治奠定轻重，是病原

4、菌和土壤中各种微生物相互作用的基础。结果（邓晓等，2012）。土壤微生物多样性与植物1　材料与方法土传病害抑制水平密切相关，根际微生物在抑制土传病害和促进植物生长过程中具有重要的作用1.1　材料（Garbevaetal.，2004a，2004b；申卫收和林先贵，1.1.1　供试病原菌　试验所用的黄瓜枯萎病2011）。PCR-DGGE技术作为一种指纹分析技术，病原菌——尖孢镰孢菌黄瓜专化型（Fusarium适合用来分析环境微生物种群多样性。近些年来，oxysporumf.sp.cucumerinum），由大连民族大学实DGGE技术已经在环境微生物研

5、究领域中广泛应用验室保存。（李怀等，2008；马俊孝等，2008；潘雪莲等，1.1.2　供试土壤样品采集　试验田设在大连民族大学的温室内，2012年4月，将从大连当地种子店赵柏霞，女，助理研究员，博士，主要从事土壤微生物与植物病理方面的研究，E-mail:zhaobaixia1979@126.com购买的黄瓜品种碧秀的种子催芽后，播种在直径*通讯作者（Correspondingauthor）：刘秋，女，教授，硕士生导师，主30cm的大花盆中。待黄瓜3～4片叶时，接种黄瓜要从事微生物学研究，E-mail:liuqiutougao@sina.co

6、m枯萎病菌。采用抖落法（张学利等，2005）分别收稿日期：2015-01-30；接受日期：2015-05-21采集黄瓜种植前的土壤（ZQ，4月18日取样）、接基金项目：国家自然科学基金项目（31070005，21276047，种黄瓜枯萎病菌前的土壤（JQ，5月20日取样）、31270057，31101477），中央高校基本科研业务费自主基金青年项目（DC13010309，DC12010103）接菌后感染枯萎病菌的黄瓜根际土壤（JB，6月17—33—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES日取样

7、）、接菌后未发病的黄瓜根际土壤（JJ，6月小约为1500bp的目的片段（图2），PCR产物的特17日取样）及接种清水的黄瓜根际土壤（CK，6异性较好。第2轮PCR反应以F338-GC/R518为引月17日取样）共5份黄瓜根际土壤样品。每份样物，扩增得到大小约为230bp的目的片段（图3）。品由5株黄瓜根际土壤充分混匀。样品取回后置于M12345678910阴凉通风处干燥，过20目筛后备用。1.2　方法23.1kb1.2.1　样品总DNA的提取　采用碱裂解法提取供试土壤样品总DNA（Huetal.，2010），用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检验，以λ-H

8、indⅢ作为Marker。图1　根