草鱼免疫应答的初步研究

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1、维普资讯http://www.cqvip.com第l5卷第耳期水生生物学报Vo1．1，．No．●ACTAHYDROBIOLOGICASlNICADec．，199I1991年12月草鱼免疫应答的初步研究江育林李燕于平(中国科学院水生生物研究所，武汉430072)提要研究了草鱼在不同水温条件下受抗原刺激后其中和抗体的变化。15℃培养条件下中和抗体上升缓慢，9周内滴度低于1：8；20屯时，3周后抗体可上升到1：256，最高远1：5ZT0，而在25屯时，1周中和抗体即达到1：570，最高可达1：2000O以上。并探索了从草鱼血清中提纯抗体

2、的条件，研究其抗体的特性。草鱼血清中的抗体为大分子蛋白，容易解离为抗原性相同，分子量近似于人IgG的较小分子，含有较多的二硫键，具有类似IgM的某些特性。关键词草鱼免疫应答，体液免疫，草鱼抗体，草鱼IgM有关鱼类对抗原的免疫应答知识是人们将免疫技术用于鱼病诊断，预防和治疗的基础。Anderson等人曾在《鱼类免疫学》一书中提及各种鱼的免疫反应情况∞，但关于草鱼免疫的描述则尚缺如。草鱼与其它鲤科鱼类相比对各种病原体特别易感，因此有必要对它的免疫应答情况进行研究。在研究过程中，我们用传染性胰脏坏死病病毒的He株(IPN—He)作为抗原

3、免疫草鱼。这是因为(I>IPN病毒对鲤科鱼类不致病，对草鱼而言它只是一种抗原而不是病原。从而排除了病理因素的干扰。(2)IPN病毒是台双链RNA的二十厩体病毒，与引起草鱼出血病的草鱼呼肠孤病毒(GCRV)十分相似。故两者的免疫反应比较，可能会使本研究更具有实际意义。(3)作者实验室内已有十分成熟的方法可将抗IPN的中和抗体灵敏，准确地检测出来。由于免疫应答是一个复杂的过程，它与草鱼的机体本身及环境因素都有关系。我们将分别在男文中予以探讨。本文主要讨论两个问题：(1)草鱼在有抗原刺激的情况下，有无抗体产生，以及抗体的产生与温度的关系

4、；(2)抗体的部分特性。材料与方法抗原制备将IPN—He病毒株接种到新鲜的PG细胞单层，于20~C培养直至纽胞病变完全。收集细胞悬浈并冻融2次后，3，000r／rain离心20rain去掉细胞碎片，然后85000r／rain离心4h沉淀病毒。沉淀用少量PBS悬液过夜，测定其病毒含量并稀释到本文中电泳扫描照片由中国科学院水生生物研究所朱兰菲老师协助铷作，特此致谢。1989年1月●日收到。维普资讯http://www.cqvip.com水生生物学报lOTCID／o．5ml，经0l弗甲醛37℃灭活3d后，作为注射草鱼的抗原，保存于一20

5、℃备用。接种抗原20条二龄草鱼(平均重约300g)喂养在自来水中，其中15条为试验组，每条注射05ml的上述抗原悬液，剩下5条为对照组。接种前每条鱼抽0．5ml血，注射抗原后每周也抽血1次以收集血清。每组鱼的血清混台在一起，经56℃30min灭活后，用中和试验测定其血清中的抗体水平。该试验共进行3次，草鱼接种抗原后分别在l5℃，20℃和25℃三种不同水温中饲养，以测定草鱼在不同水温中的抗体产生情况。中和试验用PG细胞在96孔板中测定。将经灭活的鱼血清按1：2系列稀释。100l血清与100t~l含200TCID的IPN—He病毒悬液

6、混匀后于20℃保温【b以充分中和病毒，然后接种到新鲜的PG细胞中，每血清稀释度接3孔，每孔50，并设立对照。20℃培养7d后观察细胞病变。当血清对照细胞无毒性反应；对照细胞生长正常；病毒对照为200TCID／100M时，按Rovozzo(1973)的方法计算血清中和指数。聚丙烯酰胺凝胶电泳用SDS—PAGE系统，分离胶浓度7．5％，浓缩胶浓度3％，含1弼SDS。电泳液为Tris一甘氨酸一SDS缓冲渡(pH一8．3)。电流20mA，电泳时间4h。用考马斯亮兰染色，7％醋酸脱色。硫酸饺沉淀草鱼血清将草鱼血清用等量PBS稀释后，加入一定

7、量的饱和硫酸铵，其最终浓度分别为20％，25弼，3O弗，35％，40％，45％和50％。混匀后于4℃放置lh，9000rlmin离心20min，分离上清与沉淀，用对流免疫电泳对兔抗鱼全血清以测定其中的组分。抗体提纯鱼血清中加入饱和硫酸铵使最终浓度为40％，于4℃搅拌lh后9000rlrain离心20rain收集沉淀。沉淀重悬于PBS后，再用25％的饱和硫酸铵沉淀，收集上蓿。如此重复3个轮次，即得到提纯的抗体。免疫电泳各种鱼血清及提纯的抗体均按《临床免疫技术》中描述的免疫电泳方法测定。用1％的琼脂糖，0．05M，pH8．6的巴比妥一

8、巴比妥纳缓冲液，10mA电流电泳1。5h。当加入的溴酚兰指示剂到达终点时，抗原槽内加入兔抗草鱼全血清，室温下24h即可出现沉淀线。结果草鱼在不同水温下受抗原刺激后其中和抗体效价见表1(曲线如图1)，结果表明：草鱼在抗原刺激下能产生中和抗体，并且在抗