实验十二金黄色葡萄球菌

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1、实验十二金黄色葡萄球菌检测GB4789.10-2010一、实验目的学习了解金黄色葡萄球菌的生物学特性学习掌握金黄色葡萄球菌的分离、鉴定方法及原理二、实验原理金黄色葡萄球菌属于微球菌科葡萄球菌属，可产生肠毒素，人误食了含有毒素的食品，就会发生食品中毒，因此，由该菌引起的中毒为毒素型食物中毒。生化特性典型的金葡菌呈球形，大小0.5×1.0μm。致病性菌较非致病性菌小。在液体培养基中生长，常呈双球菌或短链状排列。本菌无鞭毛及芽孢，一般不形成荚膜。革兰氏染色阳性。金葡菌耐盐性强，最适宜生长的盐浓度为5%～7.5%,可利用此特性对金葡菌增菌，抑制杂菌。可产

2、生溶血素，在血平板生生长菌落周围有透明溶血环。可产生卵磷脂酶，分解卵磷脂，产生甘油脂和可溶性磷酸胆碱。致病性金葡菌可产生血浆凝固酶。金葡菌镜下特征操作流程检样25g(mL)+稀释液225mL，均质血浆凝固酶试验7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤）BHI肉汤和营养琼脂斜面Baird-Parker平板，血平板涂片染色36℃±1℃，18h~24h结果报告36℃±1℃B-P平板18h~24h或45h~48h观察溶血血平板18h~24h菌落特征Baird-Parker平板：呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。直径2mm

3、~3mm。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。BP培养基中含有卵黄亚碲酸钾，能抑制大多数细菌繁殖，并能促进金葡生长产生黑色和晕圈。丙酮酸钠和甘氨酸也能促进金葡生长Baird-Parker平板典型菌落特征：黑色,有光泽,突起菌落并伴有透明圈，通常外层有清晰圈血平板：菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。血平板血浆凝固酶试验吸取新鲜兔血浆(冻干血浆配制)0.5mL于小试管中,加入培养24h的金黄色葡萄球菌BHI肉汤培养物0.2－0.3mL,震荡摇匀,置36

4、℃温箱或水浴内,每半小时观察一次,观察6小时,如呈现凝块,凝固体积大于原体积的一半,为阳性结果.同时以已知阳性和阴性葡萄球菌菌株及BHI肉汤作为对照.结果可疑:挑取营养琼脂斜面的菌落到5mlBHI36℃培养18—48h形态符合，血浆凝固酶阳性的为金黄色葡萄球菌结果报告：未检出/25g(mL)三、实验器材2设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：恒温培养箱、冰箱、恒温水浴箱、天平、均质器、振荡器、无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头、无菌锥形瓶：容量100mL、500mL、

5、无菌培养皿、注射器：0.5mL、pH计或pH比色管或精密pH试纸。3培养基和试剂3.110%氯化钠胰酪胨大豆肉汤：见附录A中A.1。3.27.5%氯化钠肉汤：见附录A中A.2。3.3血琼脂平板：见附录A中A.3。3.4Baird-Parker琼脂平板：见附录A中A.4。3.5脑心浸出液肉汤(BHI)：见附录A中A.5。3.6兔血浆：见附录A中A.6。3.7稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录A中A.7。3.8营养琼脂小斜面：见附录A中A.8。3.9革兰氏染色液：见附录A中A.9。3.10无菌生理盐水：见附录A中A.10。四、实验内容及操作金黄色葡萄球菌定

6、性检验程序见图5.1样品的处理称取25g样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min。若样品为液态，吸取25mL样品至盛有225mL7.5%氯化钠肉汤或10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。5.2增菌和分离培养5.2.1将上述样品匀液于36℃±1℃培养18h～24h。金黄色葡萄球菌在

7、7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生长，污染严重时在10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤内呈混浊生长。5.2.2将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker平板和血平板，血平板36℃±1℃培养18h～24h。Baird-Parker平板36℃±1℃培养18h～24h或45h～48h。5.2.3金黄色葡萄球菌在Baird-Parker平板上，菌落直径为2mm～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明圈。用接种针接触菌落有似奶油至树胶样的硬度，偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落；但无混浊带及透明圈。长期保存的冷冻或干燥食品中所分离的菌

8、落比典型菌落所产生的黑色较淡些，外观可能粗糙并干燥。在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完