分解纤维素的微生物的分解.doc

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1、分解纤维素的微生物的分离栾旭东，张兴敏，周雪霞，闫超，何溢涛（山东大学生命科学学院2005级生科基地班，济南250100）摘要：纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，它能被土壤中某些微生物分解利用，是因为它们能够产生纤维素酶。本实验通过从土壤中分离分解纤维素的微生物，初步鉴定了其形态特征和生理生化特性，为日后更进一步的研究打下基础。关键词：纤维素土壤微生物纯培养刚果红染色法Abstract:celluloseisthemostabundantpolysaccharideontheearth,whichcanbedigestedbysomemicroorganismsintheearthbe

2、causetheyproducecellulase.Inourexperiment,weisolatedthesemicroorganismsfromtheearthandcheckedupthecells’andcolonies’morphologyandthebioreactionstheycanact.Keywords:cellulose,microorganismsintheearth,pureculture,Congoredstaining资源和环境问题是人类在21世纪面临最主要的挑战。生物质资源是可再生资源，地球上每年光合作用的产物高达1.5×1011—2.0×1011，是人类

3、社会赖以生存的基本物质资源，其中90%以上为木质纤维素类物质[1]。目前这部分资源尚未得到充分的开发利用。随着世界人口迅速增长，矿产资源日渐枯竭，开发高效转化木质纤维素类可再生资源的微生物技术，利用工农业废弃物等发酵生产人类急需的燃料、饲料及化工产品，即化工原料的“绿色化”，具有极其重要的意义和光明的发展前景。地球上的植物每年产生的纤维素超过70亿吨，其中40%~60%能被土壤中的某些微生物分解利用，这是因为它们能够产生纤维素酶。而要研究这些微生物，首先要将它们从土壤中种类乏多的微生物中分离出来。1.土壤中纤维素分解菌的分离[2]土壤有“微生物的天然培养基”之称，同其他生物环境相比，土壤中

4、的微生物数量最大，种类最多。在富含有机质的土壤表层，有更多的微生物生长。实验的具体操作步骤如下。1.1土样的采集土壤中的微生物，大约70%~90%是细菌。细菌适宜在酸碱度接近中性的潮湿土壤中生长，绝大多数分布在距地表约3~8cm的土壤层。因此，土壤取样时，一般要铲去表层土。另外，土样的采集要选择富含纤维素的环境，这是因为在纤维素含量丰富的环境，通常会聚集较多的分解纤维素的微生物。综合各种因素，本小组从图书馆后院的落叶堆积丛取土样。1.2.选择培养1.2.1富集培养在将样品稀释涂布到鉴别纤维素分解菌的培养基之前，先通过选择培养增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需要的微生物。富

5、集培养所需要的仪器有：250ml锥形瓶、天平、药匙、玻璃棒、电炉、摇床、玻璃珠、称量纸等。选择培养基的制备比例见下：纤维素分解菌的选择培养基纤维素粉5gNaNO31gNa2HPO4·7H2O0.5gKH2PO40.9gMgSO4·7H2O0.5gKCl0.5g酵母膏0.5g水解酪素0.5g将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按上表比例配制50ml选择培养基。在250ml锥形瓶中装入50ml培养基，放5~6颗玻璃珠，用8层纱布做成瓶塞，将瓶口塞紧，再在瓶塞外包裹两层牛皮纸，用线绳扎紧，在121℃下高压蒸汽灭菌20min。称取土样20g，在无菌条件下加入装有50ml培养基的锥形瓶中。将

6、瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养3~4d，至培养基变浑浊。1.2.2梯度稀释所需仪器：试管（7支）、移液器、枪头。需要先经高压蒸气灭菌的仪器：试管（每只内装9ml蒸馏水）、枪头（黄色、蓝色）。用量程为1000µL的移液管从富集培养土壤液中吸取1ml土壤悬液加入盛有9ml无菌水的试管中充分混匀。然后换枪头从此试管中吸取1ml加入另一盛有9ml无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5,10-6不同稀释度的土壤溶液。1.2.3刚果红染色法分离（涂布平板）所需仪器：无菌培养皿（12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头、温箱等。需要灭菌的仪器：无菌培养皿（

7、12个）、涂布器（3个）、移液器、枪头。(1)鉴别培养基的制备培养基的制备比例如下：鉴别纤维素分解菌的培养基CMC-Na5-10g酵母膏1gKH2PO40.25g琼脂15g土豆汁100ml将上述物质溶解后,用蒸馏水定容到1000ml按以上比例配制200ml鉴别培养基和10mg/ml的刚果红（CR）溶液，灭菌后，按照每200ml培养基加入1ml的比例往培养基中加入CR溶液，混匀后倒平板，凝固后待用。(1)涂布平板将上述已倒