蓝藻藻蓝蛋白细胞工程体内重组

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1、华中科技大学硕士学位论文摘要藻胆蛋白是蓝藻中的捕光蛋白，其生物合成的重要一步是藻胆色素与脱辅基蛋白的连接。大多数藻胆色素的正确连接都需要结合位点专一和对色素的构象有选择性的裂合酶来催化完成。在集球藻Synechococcussp.PCC7002中，裂合酶CpeS能催化a-APC81位半胱氨酸残基与藻蓝胆素（PCB）的连接。裂合酶CpcE/CpcF可催化CpcA中Cys-84与PCB的连接。本课题利用分子生物学方法得到含cpcA、cpcE、cpcF基因的各种质粒并表达了相应蛋白。通过体外重组实验证明：蛋白CpcA在CpcE/CpcF

2、催化下与PCB结合形成天然产物CpcA-PCB；而在缺少CpcE/CpcF的情况下，蛋白CpcA与PCB结合形成非天然产物（CpcA-PCB、CpcA-MBV的混合物）。同时，通过体内重组证实：体内产生的PCB在有无CpcE/CpcF的情况下均能与蛋白CpcA结合并形成天然产物，所以在生物体内CpcA与PCB能进行一定程度的自催化连接反应并形成天然产物，通过荧光光谱计算其自催化比例为0.2％。本课题还通过体内重组实验证明：裂合酶CpeS对a-APC81位半胱氨酸残基与藻蓝胆素（PCB）的连接有一定的催化作用，但在缺少CpeS的情况

3、下，体内产生的PCB与ApcA结合形成天然产物的现象也十分明显，通过荧光光谱计算其自催化比例可达到56％。本课题是针对脱辅基藻胆蛋白与藻蓝胆素连接方式的研究，将有助于研究藻胆蛋白的生物合成以及藻胆体的组装，有助于藻蓝胆素色素蛋白的蛋白质工程优化的研究。关键词：裂合酶CpcE/CpcF裂合酶CpeS别藻蓝蛋白a亚基藻蓝蛋白a亚基体内重组华中科技大学硕士学位论文AbstractPhycobiliproteinsarelight-harvestingproteinspresentincyanobacteria.Themostimport

4、antstepinphycobilinbiosynthesisisthephycobilinadditiontotheapophycobiliproteins.Invivo,thecorrectattachmentofmostchromophoresiscatalyzedbybinding-siteandchromophore-specificlyases.Asweknownow,thecovalentattachmentofphycocyanobilintothea-subunitofA-phycocyanin,ApcA,isc

5、atalyzedbyCpeS.Andthecovalentattachmentofphycocyanobilintothea-subunitofC-phycocyanin,CpcA,iscatalyzedbyCpcEandCpcF.Inthiswork,Molecularbiologytechniquewasusedtoconstructexpressionplasmidscontainingsuchgenes:ascpcA、cpcE、cpcF,thenthecpcAwasintroducedintoE.coli.WithCpcE

6、andCpcF,theholophycobiliproteinsPCB-a-CPCwassynthesizedinvitro.ButWithoutCpcEandCpcF,PCB-a-CPCwasnotobtained.WealsoprovethatweatherCpcEandCpcFexistedornot,theholophycobiliproteinsPCB-a-CPCwassynthesizedinvivoreconstitution.About0.2％oftheapo-CpcAwasconvertedtoholo-CpcA

7、-PCBinasimilarlyengineeredE.colistrainthatlackscpcEandcpcF.Inthiswork,WealsoprovethatweatherCpeSexistedornot,theholophycobiliproteinsPCB-a-APCwassynthesizedinvivoreconstitution.About56％oftheapo-ApcAwasconvertedtoholo-ApcA-PCBinasimilarlyengineeredE.colistrainthatlacks

8、cpeS.Inthiswork,westudiedwaysofphycobilinadditiontotheapophycobiliproteins.Itisusefulforustofindbetterwaysofstudyingphycocya