半花菁类荧光探针的构建及应用研究

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1、分类号：１０６９７：０６５７学校代码密级：２０１４１０１２：公开学号９ＮｏｒｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ傅士字位论文ＤＯＣＴＯＲＡＬＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ半花菁类荧光探针的构建及应用研究－学科名称：分析化学作者：张晟瑞指导老师：杨ｉ小＝峰教杈西北大学学位评定委员会二〇一八年DevelopmentofFluorescentProbesBasedonHemicyaninesandTheirApplicationsAdissertationsubmittedtoNorthwestUnivers

2、ityinpartialfulfillmentoftherequirementsforthedegreeofDoctorofPhilosophyinAnalyticalChemistryBySupervisor:LiHuaProfessorYangXiaofengProfessorJune2018摘要摘要半花菁染料属于花菁的一种，具有摩尔吸光系数较大、吸收和发射波长相对较长、荧光量子产率较高、斯托克斯位移大等优点，在合成荧光探针时备受青睐。但是半花菁类染料结构上没有可以修饰的参与共轭的基团，难以用保护去保护的方式来构建荧光探针。因此，有必要开发新的识

3、别机理来构建基于半花菁染料的荧光探针。非完全N烷基化的半花菁中含有席夫碱基团（SB，-C=N-），通过调控席夫碱中N原子的质子化（PSB形式）/去质子化平衡的移动，可实现对半花菁光谱的调控。此外，改变半花菁染料中席夫碱附近基团的吸电子能力，将会引起半花菁席夫碱pKa值的变化，从而引起染料光谱性质的显著改变，这种半花菁席夫碱的SB和PSB形式之间平衡的移动为调整染料光学性质提供了一个新策略。本论文的主要工作是通过分子识别反应调控半花菁的SB形式和PSB形式在水溶液中的平衡，构建了检测相邻巯基蛋白（VDPs）、硒代半胱氨酸（Sec）和苯硫酚的新型荧光探针

4、。主要工作如下：（1）利用分子识别反应可改变半花菁荧光探针（MCAs）所处的微环境，从而改变MCAs中亚胺基团的pKa值。据此原理，我们构建了一个专一检测VDPs的荧光探针。在水溶液中，MCAs亚胺基团的pKa为4.8，因此在生理pH条件下（pH7.4），MCAs主要以席夫碱（SB）的形式存在。由于缺乏可产生共轭的正电荷，MCAs的吸收波长较短且基本没有荧光。当MCAs与还原性牛血清蛋白（rBSA）结合之后（rBSA为VDPs的模型蛋白），MCAs从水相进入rBSA的疏水腔体，从而导致MCAs的pKa值显著升高（pKa=7.1）。因此，在生理pH条件

5、下，MCAs质子化席夫碱（PSB）的形式增多，从而导致检测体系的吸收波长显著红移，同时荧光强度显著升高。该探针对VDPs的检测具有很好的灵敏度和选择性，利用该探针成功实现细胞中VDPs的成像分析。（2）文献报道，吸电子基团可以显著减低亚胺基团pKa值。据此原理，我们在半花菁席夫碱的结构中引入强吸电子能力的2，4-二硝基苯磺酰基，构建了专一检测硒醇的荧光探针MC-Sec。MC-Sec的pKa值为6.40，在生理pH下，它主要以其SB形式存在。由于缺少亚胺阳离子，MC-Sec的SB形式荧光信号微弱。当向其溶液中加入Sec后，Sec可以和MC-Sec中的2

6、，4-二硝基苯磺酰胺键发生亲核取代反应，I西北大学博士学位论文释放出pKa值较高的荧光团MCP（pKa=9.0）。因此，在生理pH条件下，MCP主要以其质子化席夫碱（PSB）的形式存在，从而导致检测体系的吸收波长显著红移，荧光强度显著升高。该探针对Sec的检测具有高的选择性和灵敏度，并可实现血清和活细胞中内源性和外源性Sec的检测。（3）在前面工作的基础上，根据半花菁甲川链上引入桥环结构，会使半花菁染料的波长红移及吸电子基团可以显著减低亚胺基团pKa值的原理，我们构建了一种可专一检测苯硫酚的近红外荧光探针MCSH。该探针的发射波长在627nm，pKa

7、为4.11。中性条件下，它主要以没有荧光的SB形式存在。与苯硫酚反应后，MCSH内的2，4-二硝基苯磺酰胺键断裂，释放出MCPD（pKa值为8.11）。中性条件下，它主要以PSB的形式存在，从而使得检测体系的荧光发射波长发生红移，荧光信号增强，实现了苯硫酚的检测。MCSH对苯硫酚的检测具有很好的专一性和较高的灵敏度。该近红外荧光探针不仅可实现实际水样中苯硫酚的定量检测，还成功实现了活细胞中苯硫酚的生物成像。（4）除了上面三个工作之外，本论文还通过将罗丹明6G酸中两个N原子亚硝化的方法，合成了一种新型光控NO供体NOG。该供体在水溶液中以无色无荧光的螺

8、内酯形式（关环）存在。被365nm紫外光照射后，NOG可释放出NO和罗丹明6G酸（开环形式），在547nm处